5分钟讲透：荧光原位杂交技术步骤和注意事项

营养师

一、什么是FISH？
荧光原位杂交，英文全称叫Fluorescence in situ hybridization，通常根据首字母简称FISH。
这项技术始于传统细胞遗传学同DNA技术相结合而开创的一门新学科——分子细胞遗传学技术。是二十世纪八十年代末期，在原有的放射性核酸探针原位杂交技术的基础上，发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
二、FISH原理是啥？
荧光原位杂交技术根据碱基互补配对原则，通过变性复性使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。
通俗来说，原理是利用荧光标记的DNA探针与要检测的DNA或者RNA上的特定区域杂交。





荧光：利用荧光素标记特异性的DNA片段（探针）
原位：要测定的目标原本所在的位置，通常是细胞核里面的DNA
杂交：探针与目标DNA或者RNA特异性结合
三、为什么需要做FISH?
肿瘤治疗中有一种非常重要的治疗方法：靶向治疗。目前，普遍的共识是，如果需要使用有明确作用靶点的药物，需要进行靶点检测后方可使用，不得在未做相关检查的情况下盲目用药。
此外，目前FISH技术在乳腺癌、胃癌、淋巴瘤和各类软组织肿瘤等肿瘤的辅助诊断中起着很大的作用；还能够通过检测其分子遗传学异常来预测疾病预后，并指导靶向治疗。
四、检测报告上那些红红绿的的信号代表什么？
绿色和红色是目前FISH检测常用的探针荧光素标记颜色。



FISH的探针类型大致可分为：着丝粒探针(centromere-enumeration probes，CEP)和位点特异性探针(locus-specific identifier probes，LSI)。
LSI探针又分为计数探针和融合/分离探针，这种探针在临床上应用更为广泛。LSI的各类探针检测结果对应的则是染色体/基因的扩增、缺失、融合、断裂等。



① 计数探针是通过标记一段特异性的DNA片段，然后数信号的数量，从而判断染色体或基因状态。
由于正常人的染色体/基因是二倍体，那么正常人的检测信号就是两个。排除影响后，当信号多于两个或者少于两个，便可判断染色体或者基因发生了异常（扩增或缺失）。
② 融合/分离探针是基因有时候会在某些位置断开，运用不同颜色荧光素标记断裂点两端特异性的DNA片段，通过信号点颜色的变化判断是否发生了融合/分离。
基因没有发生重排时，探针标记的红绿信号因相隔距离太近而肉眼观察呈现黄色；如果发生断裂，则形成信号原始的颜色（单独的红或绿，或者分离的红绿信号）。此外，此类探针同样能够提示数目异常（如多倍体）。



在荧光显微镜下，通过不同颜色的荧光通道观察细胞核内不同探针标记的位置，各层通道图片叠加后就可用于判读是否发生基因变异从而出具诊断结果。
五、FISH常见的临床应有哪些？
1.指导用药：由于某些基因变异区域正是靶向治疗的靶点，故可以选择对应的靶向药物进行治疗。如HER2基因扩增的乳腺癌患者明显受益于靶向药物赫赛汀（Herceptin）。
2.鉴别诊断：结合IDH突变，1P和19Q共缺失可用于鉴别诊断少突胶质细胞瘤。
3.预后判断：例如HER2基因扩增与乳腺癌患者预后差相关；5-15%的弥漫大B细胞淋巴瘤患者存在MYC断裂。FISH检测可以明确相关基因的具体情况，从而判断其预后。
4.辅助诊断：病理诊断时，已经做了形态学和相关免疫组化的病理检测，但是病理医生还是没有办法完全确认是否为某一肿瘤，这时候便可通过使用FISH技术中的相关探针的检测来辅助确诊。如MDM2基因扩增可用于辅助诊断高分化脂肪肉瘤，帮助诊断去分化脂肪肉瘤、高分化骨肉瘤在骨肿瘤与良性或反应性骨病变。EWSR1基因断裂可用于辅助诊断尤文肉瘤及粘液脂肪肉瘤，促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤，透明细胞肉瘤等。六、做一个FISH需要多久才能出报告？
前处理流程
1、烤片：80℃烤片30分钟；
2、脱蜡：浸入提前37℃预热的脱蜡剂中漂洗4次，每次10分钟，共计40分钟；
3、洗片：取出玻片后室温下浸入100%乙醇中5分钟，重复一遍；
4、复水：取出玻片后分别浸入80%、75%梯度乙醇和去离子水中各3分钟；
5、通透：取出玻片后浸入煮沸的通透剂中30分钟；
6、酶消化：取出玻片后浸入预热的37℃胃蛋白酶工作液中消化10分钟左右；
7、洗片：取出玻片后浸泡于洗涤液（2×SSC）中漂洗两次，每次5分钟；
8、脱水：取出玻片后分别浸入70%、85%和100%梯度乙醇各3分钟；
9、干片：取出玻片后室温晾干即可即可进行杂交试验操作。
变性杂交
1．取出探针，室温静置5分钟，上下颠倒混匀探针后短暂离心，取10μL滴于杂交区域，立即盖上与组织大小相符的盖玻片，并用橡皮胶封边；
2．将玻片置于杂交仪上，85℃共变性5分钟，37℃杂交过夜。
洗涤和复染
1、取出杂交后的玻片，去除盖玻片上的橡皮胶，将切片浸入2×SSC中约5秒，用镊子轻轻将盖薄片揭去；
2、将切片置于37℃预热的2×SSC浸泡40分钟；
3、取出玻片浸入提前60℃预热的2×SSC 10分钟，然后浸入0.1%NP-40/2×SSC溶液中洗涤5分钟；
4、 取出浸入75%乙醇中，浸泡3分钟；
5、将10μLDAPI复染剂滴于杂交区域，立即盖上盖玻片；
6、暗处静置10min，最后使用荧光显微镜观察。



最后，一般情况下经过5-7天，可以出具FISH诊断报告。
总之，荧光原位杂交技术（FISH）具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位精确、一张玻片上可以使用多种颜色标记等优点。

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