流式细胞术原理、分析及应用整理——（一）

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流式细胞术的概述

• 流式细胞术：是利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术
  
• 流式细胞仪的分类：流式分析仪、流式分选仪（流式分析不能够实现流式分选，但流式分选能够实现流失分析）
  
• 原理：特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流内的细胞，产生的光信号被多个接收器所接收，一个是再激光束直线方向上接收到的散射光信号（前向角散射），其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号，包括散射光信号（侧向角散射）和荧光信号。液流中悬浮的直径从0.2-150μm的细胞或颗粒能够使激光束发生散射，细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收，根据接受到的信号的强弱波动从而反映每个细胞的物理学特征。（通俗的将就是激光束照射由鞘流液包裹的细胞，产生两种光信号，即散射光信号和荧光信号）
  
• 流式细胞术的三大要素：流式细胞仪（工具）、样品细胞（原材料）、荧光染料或荧光素偶联抗体（可视化标记）
  

流式图分析

在分析流式图之前我们需要清楚流式通道的概念和所检测的内容

• 流式通道：主要分为散射光通道和荧光通道，散射光通道一般包括FSC（前向散射光）和SSC（侧向散射光）通道，现有的流式细胞仪均含有这两个散射光通道，主要的差别在于荧光通道的多少。
  
• FSC——代表了细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC值就越大，可利用FSC值初步比较细胞体积的大小，并利用此测量值对细胞进行分群和分类（FSC-H、FSC-W、FSC-A表示的是电子波的长度、宽度和面积，由于获得数据是光信号，需要从光信号转变为电信号才能够实现测量）
  
• SSC——代表了细胞的颗粒度，细胞越不规则，细胞表面的突起就越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或颗粒物质就越多，SSC值就越大，可利用此值比较细胞的颗粒度
  
• 在研究细胞样本时，我们首先看到的就是样品细胞的FSC-SSC散点图，X轴为FSC值，Y轴代表SSC值。此分析不需要标记任何荧光素偶联抗体，直接上样分析就能够得到结果，此散点图又称为样品细胞的物理图
  

流式直方图

• 流式直方图形成原理和统计学中的直方图类似，就是在统计学直方图的基础上进一步发展而来。直方图的X轴表示一个通道值，Y轴表示细胞数量（以下数据只是简单示例）
  

FSC通道值区间	位于该区间的细胞数
10-20	6
20-30	14
30-40	22
40-50	14
50-60	6
60-70	0
70-80	0
80-90	9
90-100	20
100-110	9

由此我们可以得到一个数据直方图（我就不画图了，学过统计学就可看出此数据有两个峰），可见根据细胞体积可以将细胞分为两群细胞，第一群FSC的通道平均值在35左右，占62%，第二群FSC的通道平均值在95左右，占38%，由此可知道，这100个细胞中样品细胞是由细胞大小明显不同的两类细胞组成，且小细胞占多数。

• 流式直方图就是将统计区间不断的缩小，统计的细胞数目不断增加，由此相邻的小统计区间内的细胞数相差不多，这时直方图就像是光滑的曲线所组成
  

• 上图就是累积显示不同样本细胞总数的流式直方图。图中使用的是正常小鼠的脾脏细胞，标记FITC偶连的抗CD4抗体。图A是累积显示50个细胞的直方图，图B是累积100个细胞，图C是累积500个细胞，图D是累积1000个，图E是累积10000个，图F是累积100000个。从图上分析可得细胞主要分为CD4阳性和CD4阴性两个群体细胞，各自曲线下所围成的面积占总面积的比例就是两群细胞各自的占比，其中CD4阳性细胞群占32.5%。
  
• 由此例子我们可得知道，流式直方图是累计显示细胞量特别大而统计区间特别小的统计直方图。
  
• 提醒：图上我们看到，两个细胞群各自呈现正态分布曲线，但并不表示这群细胞的CD4阳性细胞之间的CD4表达量有差异，他们之间的表达量是相同的，产生这种正态分布的原因是因为流式检测值与实际值之间存在一定的差异。呈现典型的正态分布说明基本上细胞没有差异，否则存在差异。
  

<hr/>今天就介绍流式细胞术的基本原理和流式直方图的相关分析，接下来我们将继续探讨流式散点图、流式等高线图的分析。

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