CRISPR-Cas9技术的原理和应用

风云

在生物技术领域，CRISPR-Cas9技术的出现被誉为一次科学革命，它不仅改变了我们对基因编辑可能性的理解，而且也正在重塑我们对遗传疾病治疗和生物研究方法的认知。



图. CRISPR/Cas9 系统 [1]

CRISPR-Cas9源自细菌的一种自然免疫机制，该机制能够识别并剪切入侵的病毒DNA，从而保护细菌免受外部遗传物质的侵害。科学家们通过研究这一天然现象，开发出了一种可以在几乎任何生物体内精确修改基因的工具。这种技术的开发不仅仅是一个技术性的突破，它的应用前景和挑战也是当前科学研究的热点话题。
<hr/>技术原理：

• CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）是一类在细菌和古菌的基因组中发现的DNA序列。这些序列由重复的基序和间隔序列组成，间隔序列通常来源于过去入侵的病毒DNA。
  

图. CRISPR-Cas系统中典型的CRISPR位点的结构和功能流程 [2]

• Cas9（CRISPR-associated protein 9，CRISPR相关蛋白9）是一种核酸酶，它在CRISPR-Cas9系统中负责识别并切割DNA。Cas9的功能依赖于与之配对的gRNA，这种RNA包含了一个与目标DNA序列互补的区域，使得Cas9能够精确地识别和结合到特定的DNA序列。一旦识别并结合到目标DNA，Cas9会在特定位置（通常是在所谓的PAM序列附近）进行双链切割。
  

图. 不同亚型的Cas9同源酶的结构域 [2]

• 指导RNA（guide RNA, gRNA）是CRISPR-Cas9系统中的关键组成部分，它由两部分组成：CRISPR RNA（crRNA）和辅助RNA（tracrRNA）。在实际应用中，这两个RNA通常被合成为一个单一的导向RNA分子（sgRNA）。sgRNA的设计使其能够通过互补配对精确识别目标DNA序列。
  

图. sgRNA二级结构的示意图 [2]

• 目标识别和DNA切割：CRISPR-Cas9系统的工作开始于sgRNA和Cas9蛋白形成复合体，并导航至目标DNA。sgRNA的一部分与目标DNA的互补序列结合，而这种结合通常需要在目标序列旁边存在一个短的PAM序列（原核效应因子动员位点）。PAM序列是Cas9识别和结合DNA所必需的。
  

一旦Cas9酶通过sgRNA被正确地引导到目标位置，它就会在特定位置对DNA双链进行切割。这种切割导致DNA双链断裂（double-strand break，DSB），触发细胞的DNA修复机制。



图. CRISPR/Cas9功能及其SpCas9变体概述

图注：(A) Cas9核酸酶依靠其绑定的sgRNA互补配对，定位到目标DNA。该位点后必须跟有3′ PAM序列（NGG、NAG），并通过切割双链DNA触发修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。(B) sgRNA的结构包括20个核苷酸的目标序列和一个为Cas9结合设计的手柄区域。通过特定碱基增强了sgRNA的稳定性。（C）几种SpCas9融合蛋白及其生物效应：激活型的dCas9-VP64（绿色），抑制型的dCas9-KRAB（红色），以及进行表观遗传修饰的dCas9-DNMT3A（紫色）和进行单核苷酸编辑的dCas9-AID（黄色）。

• DNA修复：细胞尝试修复DSB主要通过两种途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ是一种错误倾向的修复过程，可能在修复处引入插入或缺失，常用于基因敲除。而HDR则是一种高精度的修复机制，如果在编辑过程中提供了同源DNA模板，可以在特定位置精确地插入或更正DNA序列。
  

CRISPR-Cas9技术的这些基本原理使其成为一种强大的基因编辑工具，能够在多个生物学系统中进行高效和精确的基因修改。通过这种技术，科学家们能够探索基因的功能，治疗遗传病，甚至创建经过改良的作物和动物模型。
<hr/>技术应用：
CRISPR-Cas9技术的应用领域广泛，从基础科学研究到临床应用、农业和生物工程等多个领域都有显著的影响。
1. 基因功能研究
CRISPR-Cas9技术使科学家能够在细胞和动物模型中精确敲除或修改特定基因，从而研究这些基因的功能和相关病理机制。例如，通过敲除某个基因，研究者可以观察到失去该基因表达后的生理变化，从而揭示其在生物体中的作用。目前，CRISPR-Cas9技术在基因功能研究领域的应用已在许多的科学期刊中发表。


https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=crispr-cas9+knockout


这篇文章首次描述了CRISPR-Cas9系统可以被编程来切割特定的DNA序列 [3]。


2. 遗传疾病治疗
CRISPR-Cas9技术的另一个重要应用是在治疗遗传性疾病方面。通过直接修正患者基因组中的致病基因突变，可以根本性地治疗疾病。例如，CRISPR已被用于在体外模型和临床前试验中纠正β地中海贫血和镰状细胞病的基因突变。


这篇综述讨论了CRISPR-Cas9技术在基因和细胞治疗中的应用，包括治疗遗传性疾病的潜力 [4]。


3. 农业改良
在农业领域，CRISPR-Cas9技术被用来增强作物的耐病性、耐旱性和营养价值。通过编辑作物基因，科学家可以开发出更适应环境变化的新品种，例如抗虫害的玉米和高产量的水稻。


该文描述了CRISPR-Cas9在作物基因编辑中的多种应用，包括提高抗病性和改善农艺性状 [5]。


4. 微生物工程
CRISPR-Cas9技术在微生物工程领域也展示了巨大的潜力，例如通过基因编辑改造微生物以生产生物燃料、药物或其他有价值的化学物质。这种技术使得微生物的代谢途径可以被精确调控，从而优化产物的生成。


该文细致探讨了CRISPR-Cas9技术如何被用于微生物细胞工厂的改造，尤其是在提高代谢产物产量和改善代谢途径的应用 [6]。


5. 生物安全和环境保护
CRISPR技术也被用于生物安全和环境保护项目，如通过基因驱动（gene drive）技术控制害虫数量或治理侵入物种。此外，通过修改动物基因来控制传播疾病的昆虫或其他载体的能力，从而减少疾病的传播。


这篇文章展示了如何利用CRISPR-Cas9技术在蚊子中建立基因驱动，以控制疟疾传播 [7]。


6. 生物制剂的开发
在生物制药领域，CRISPR-Cas9可以用来修改哺乳动物细胞的基因，优化药物生产过程中的蛋白质表达和修饰。这对于生产具有复杂结构的生物制剂，如抗体药物，尤为重要。


这篇研究描述了如何使用CRISPR-Cas9在烟草中引入病毒抗性，这对于生产病毒抗性的植物生物制剂具有重要意义 [8]。


CRISPR-Cas9 技术作为一种强大的基因编辑工具，已广泛应用于医学、农业和生物科学研究。通过精确修改基因，它不仅促进了遗传疾病的治疗研究，还改良了作物抗性和微生物生产能力，展示了其在科技发展中的巨大潜力和价值。希望今天的分享对你有用。
<hr/>参考文献：
[1] M. Redman, A. King, C. Watson, and D. King, “What is CRISPR / Cas9 ?,” Arch. Dis. Child. Educ. Pract. Ed., pp. 213–215, 2016, doi: 10.1136/archdischild-2016-310459.
[2] F. Jiang and J. A. Doudna, “CRISPR – Cas9 Structures and Mechanisms,” Annu. Rev. Biophys., pp. 505–529, 2017.
[3] M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, and E. Charpentier, “A Programmable Dual-RNA – Guided,” Science (80-. )., vol. 337, no. August, pp. 816–821, 2012.
[4] M. L. Maeder and C. A. Gersbach, “Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy,” Mol. Ther., vol. 24, no. 3, pp. 430–446, 2016, doi: 10.1038/mt.2016.10.
[5] L. G. Lowder et al., “A CRISPR / Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation 1 [ OPEN ],” Plant Physiol., vol. 169, no. October, pp. 971–985, 2015, doi: 10.1104/pp.15.00636.
[6] M. Deaner and H. S. Alper, “Enhanced scale and scope of genome engineering and regulation using CRISPR / Cas in Saccharomyces cerevisiae CASSETTE ASSEMBLY FOR MULTIPLEXED,” FEMS Yeast Res., no. October, pp. 1–10, 2019.
[7] A. Hammond et al., “LETTERS A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae,” Nat. Biotechnol., vol. 34, no. 1, 2016, doi: 10.1038/nbt.3439.
[8] D. E. Pyott, E. Sheehan, and A. Molnar, “Engineering of CRISPR / Cas9-mediated potyvirus resistance in transgene-free Arabidopsis plants,” Plant Mol. Biol. Report., vol. 7, no. 20 16, pp. 1276–1288, 2016, doi: 10.1111/mpp.12417.

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