流式细胞术从零开始说

幸福侠侣

流式细胞术(flow cytometery)是利用流式细胞仪(flow cytometer)对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒等进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析信息全面、分选纯度高、方法灵活等特点，可用于细胞大小、细胞颗粒度、DNA及RNA含量、蛋白质含量、细胞特异抗原、细胞活性、胞内PH值、细胞周期、细胞凋亡、细胞功能分析等的检测。



abs50001 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

通过流式细胞术进行细胞凋亡分析

FITC Annexin V染色的流式细胞术分析。 Human PBMC用12uM喜树碱处理4h。将细胞与FITC Annexin V在含有碘化丙啶(PI)的缓冲液中孵育，并通过流式细胞术进行分析。经过2h的处理，主要有三组细胞：活细胞（FITC Annexin V和PI阴性）和凋亡早期（FITC Annexin V阳性和PI阴性）和FITC Annexin V和PI双阳性的细胞。
流式细胞术的基本原理

深入了解流式细胞术的基本原理，必须了解流式细胞仪，流式细胞仪的基本元件包括液路系统、光路系统以及电子系统三个部分。



液路系统：确保细胞单个排列通过，每次分析一个细胞；
光路系统：产生、收集、分离和转换光信号，为后续的数据分析提供基础；
电子系统：处理和保存由光学系统检测到的信号，并将这些信号转换为可用于分析的数字数据。
液路系统

液路系统的作用是将样品排列成单列细胞/颗粒流，并使细胞/颗粒稳定高速的通过流式细胞仪的检测点，主要包含流动室+鞘液+废液+上样器+压力控制系统



● 上样速度越高，样本中心液流(sample core)越粗，激光聚焦越差，分辨率越低；
● 定性测量一般对流速要求不高，例如免疫分型；
● 定量测量严格要求低速，例如细胞周期检测。
流式细胞中的光信号

1、散射光信号

散射光信号是细胞的固有参数，不需要使用荧光标签；



● 前向散射光(forward scatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关；
● 侧向散射光(side scatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关；
● FSC-SSC的作用：利用细胞大小和颗粒度初步区分细胞群、去除细胞碎片、去除黏连细胞。



从细胞进入激光照射区到离开，产生一个电脉冲信号。H是脉冲高度，代表脉冲信号的峰值；W是脉冲宽度，是指细胞通过激光照射区域的时间；A是脉冲信号的面积。

实际操作中，部分细胞与细胞会粘在一起，连续通过激光照射区，被仪器认定为一次信号，对我们最终的数据分析造成干扰。当粘连体出现测量高度不变，宽度和面积变为两倍，即出现FSC-Height不变，FSC-Area和Width增大的现象。



我们可以使用FSC-A与FSC-H来排除粘连体，正常单细胞通过流式细胞仪激光照射区时，H和A是成正比增大的，而粘连体通过时，H不变，A增大，因此，可通过细胞的FSC-A(Area)与FSC-H(Height)参数完美排除掉粘连体，也可以通过FSC-H与FSC-W来操作，但此种方法对于复杂样本（样本中各种细胞大小差异较大）不太适用，实际上，去除粘连体的重要步骤在样本制备阶段。
2、荧光信号

在流式细胞术中，荧光信号的产生是由于特定的荧光素分子吸收一定波长的光后跃迁到激发态，然后释放光子（荧光）回到基态。了解荧光信号的产生以及各部分元件，有助于我们多色配色。



激光：提供单色光束，用于激发细胞中的荧光标记物，常见激光器有355nm（紫外）、405nm（紫色）、488nm（蓝色）、561nm（黄绿色）、633nm（红色）。有的流式细胞仪只配备488nm；有的流式细胞仪配备两种激光器如488nm与638nm。多色流式则可能需要更多的激光器。
滤光片：通常包括带通滤光片、长通滤光片、短通滤光片，带通滤光片。带通滤光片允许一个固定范围内波长的光通过。如BP530/30表示允许波长515nm-545nm范围的光通过，长通允许特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过。短通滤光片使特定波长以下的光通过。
分光棱镜：将激光器发出的光线和细胞散射或荧光发射出来的光线分开，确保不同颜色的荧光可以被不同的检测器准确地捕捉到。
荧光信号检测器：检测分光棱镜分离出的荧光信号。每个检测器对应一个特定的荧光波长，用于测量细胞中特定荧光标记物的强度。
电子系统





主要负责处理和数字化由光学系统检测到的光信号
放大：当细胞或颗粒通过检测点时，激光束照射到它们上产生的光信号（包括前向角散射(FSC)、侧向散射(SSC)和荧光信号）被光电倍增管(PMT)或光电二极管(PD)探测到，并转化为电信号。这些初始的电信号通常很弱，需要通过信号放大器进行放大。
模数转换(ADC)：放大后的电信号通过模数转换器(ADC)转化为数字信号。ADC的位数（如14到24位）决定了信号的解析率和能转化的数值范围。
脉冲分箱(Pulse Processing)：每个细胞的所有参数的电压脉冲会被进行分箱，即按照一定的采样率和ADC的解析率，将模拟信号转换为数字信号，并存储为数据以备后续分析。
数据存储与分析：数字信号被传送到电脑，存储为数据文件，以备分析。这些数据文件通常以标准的流式细胞仪文件格式输出，如FSC数字数据文件。
流式好物推荐

货号	产品名称	规格
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abs50090	小鼠肿瘤组织解离试剂盒	10T/25T
abs50091	小鼠肝脏组织解离试剂盒	10T/25T
abs50092	小鼠肺脏组织解离试剂盒	10T/25T
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abs50096	小鼠胰腺组织解离试剂盒	10T/25T
abs50097	小鼠脾脏组织解离试剂盒	10T/25T
abs50098	小鼠脑组织解离试剂盒	10T/25T
abs50055	组织酶解试剂盒	1kit
abs9101	红细胞裂解液（1×）	100mL/500mL
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abs9102	细胞分离液	100mL
abs9474	组织保存液	100mL
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abs9934	Stimulation Cocktail Kit,Without GolgiPlug	100T
abs9935	Stimulation Cocktail Kit,With Brefeldin A	100T
abs9936	Fixation/Permeabilization Kit	100T
abs9937	Fixation/Permeabilization Kit,With Brefeldin A	100T
abs9488	鞘液	20L
abs9477	小鼠 Fc 受体阻断剂	200T/500T
abs9476	人 Fc 受体阻断剂	50T/200T
abs9107	佛波酯	1mg/5mg/25mg
abs9108	离子霉素钙盐	1mg/5mg
abs970	D-PBS缓冲液（1×，无钙镁）	500mL
abs810012	Brefeldin A	10mg/25mg/50mg
abs812975	Monensin sodium salt	25mg/100mg
abs9475	细胞染色缓冲液	500mL
abs9110	固定剂	50mL

染料	最大激发光	最大发射光
MF450	405 nm	450 nm
BZY405	405 nm	455 nm
Pacific Blue	405 nm	455 nm
BZY500	405 nm	500 nm
BZY515	405 nm	525 nm
MF500	405 nm	525 nm
MF510	405 nm	525 nm
MF540	405 nm	525 nm
AF488	490 nm	525 nm
FITC	494 nm	520 nm
PE	496 nm, 565 nm	578 nm
PE-CF 594	488 nm	610 nm
PerCP	482 nm	678 nm
PerCP-Cy5.5	482 nm	690 nm
PE-Cy5.5	496 nm, 565 nm	690 nm
PE-Cy7	496 nm, 565 nm	782 nm
AF555	555 nm	572 nm
PE	496 nm, 565 nm	578 nm
AF594	590 nm	617 nm
PE-Cy5	565 nm	667 nm
PE-Cy5.5	496 nm, 565 nm	690 nm
PE-Cy7	496 nm, 565 nm	782 nm
APC	650 nm	660 nm
AF647	650 nm	665 nm
Cy5	650 nm	670 nm
APC-Cy5.5	651 nm	700 nm
APC-AF700	640 nm	712 nm
AF700	695 nm	720 nm
APC-Cy7	650 nm	767 nm

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