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[分享] 免疫荧光

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发表于 2024-12-17 15:22 | 显示全部楼层 |阅读模式

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免疫荧光(Immunofluorescence,IF)技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,将抗体分子与一些示踪标记结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位和定量。免疫荧光技术可以对目的蛋白在细胞中的定位提供更高的分辨率、更高的灵敏度,是目前在细胞水平进行蛋白量(定性为主)及蛋白定位分析最常用的方法。
载基可将玻璃切片上的所有信息进行采集形成高分辨率的数字切片,防止荧光淬灭;可任意倍数进行观察;可满足临床、科研、教学等多种用途。
载基优势:
采用进口abcam、CST、Santa、omnimabs抗体;
光学显微镜和荧光显微镜齐全,一站式完成实验;
具有多年免疫荧光实验经验;
可免费使用我司细胞库、组织库已有细胞或石蜡切片,无需购买;
提供完整的实验数据及实验报告(包括实验仪器、试剂、方法步骤、结果、数据分析、结论等)。
实验流程:
细胞爬片固定/石蜡脱蜡至水-封闭-孵育一抗-孵育荧光二抗-封片镜检
实验步骤:
1、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ 5min-二甲苯Ⅱ 5min-二甲苯 III 5min-无水乙醇1min-95%乙醇1min-85%乙醇1min-75乙醇1min-65%乙醇1min,自来水洗。
2、抗原修复:将EDTA抗原修复液(PH9.0)用蒸馏水稀释50倍,并加热至沸腾。将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上,放入不锈钢锅中;将功率调至最小(处于保温状态),盖上锅盖,继续加热20分钟后,离开热源,自然冷却10分钟;用自来水冲淋不锈钢锅外壁使之冷却,待锅中液体冷却至室温后取出切片;蒸馏水冲洗3分钟x3次;用PBS溶液冲洗3分钟x3次;
3、灭活:除去PBS,在切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂,室温下孵育10分钟,用PBS溶液冲洗3分钟x3次;
4、封闭:除去PBS,在切片上滴加5%BSA封闭液室温下孵育30min;
5、加一抗:轻轻甩掉封闭液,切片上滴加第一抗体,4度孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发);
6、加二抗:取出湿盒,复温40min左右,用PBS溶液冲洗3分钟x3次,除去PBS,切片上滴加与一抗相应种属的荧光二抗,室温下避光孵育1h,PBS冲洗3x3分钟;
7、DAPI 复染细胞核:除去PBS,切片稍甩干后在圈内滴加 DAPI 染液,避光室温孵育 10min,PBS冲洗3x3分钟;
8、淬灭组织自发荧光:除去PBS,在圈内加入自发荧光淬灭剂 避光室温孵育5min,流水冲洗 10min;
9、 封片:切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片;
10镜检拍照:切片于荧光显微镜下观察并采集图像。(DAPI 紫外激发波长 330-380nm, 发射波长 420nm,发蓝光;FITC 激发波长 465-495nm,发射波长 515-555 nm,发绿光;CY3 激发波长 510-560,发射波长590nm,发红光。
结果观察:DAPI 染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿光。







原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/700881858
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