免疫组化实验操作要点有哪些？

千姿百态

免疫组化实验操作要点有哪些？
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检验医师

用EDTA抗原修复的时候，可以把切片浸入后，微波炉先中高火8分钟，然后在微波炉静止保温6分钟，然后在低火8分钟，最后拿出微波炉，室温冷却，再继续后续实验。抗原修复效果还不错，如果多次实验效果都不好，可以考虑改变一下抗原修复的加热时间。

感恩由您

小白：江湖救急！！江湖救急！！
萌 Cece：什么事这么着急？说来听听~
小白：导师心血来潮，突然让我做 IHC 实验，完全不知道从何下手啊！！
萌 Cece：哈哈，这不巧了嘛!我刚整理了 IHC 实验操作指南，里面包含了所有操作流程和注意事项，拿走不谢~

1 免疫组织化学（IHC）


免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)，一种用于检测组织切片中特定抗原或蛋白质的方法。以已知的抗体为探针，与组织或细胞中的特定抗原(如多肽、蛋白质等)进行特异性的结合。随后，利用化学反应将这些抗原-抗体复合物进行可视化，从而实现对未知抗原在组织或细胞中的定性、定位甚至定量研究。




图 1. 免疫组织化学 (IHC) 原理图。

IHC 检测可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。直接检测方法是直接与偶联物 (例如荧光染料、酶、胶体金或生物素) 结合标记的一抗的一步过程。直接法快速，但对于检测常规处理的组织中的大多数抗原缺乏足够的灵敏度(图 2)。




图 2. 直接和间接免疫组织化学 (IHC) 方法[1]。

为了满足灵敏度更高的抗原检测的需求，Coons 等人开发了一种两步法。第一层抗体未标记，而第二层抗体(针对一抗而产生)则被标记(图 2)。

<hr/>间接法的灵敏度高于直接法：
未标记的一抗保留了完全的亲和力，具有更强的抗原结合力，并且每分子一抗的标记物（例如过氧化物酶）数量更多，从而增加了反应强度。

• 间接法可以用较少的一抗检测较少量的抗原，用于放大一抗信号，因为一个一抗至少可以结合两个带标记的二抗。
  
• 间接法也比直接法更方便，因为相同的二抗可用于检测不同的一抗，前提是后者是在同一物种中产生的。
  

<hr/>2 IHC实验怎么做？


IHC 实验流程：通常包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察 12 个部分。




图 3. 免疫组化（IHC）流程图[2]。

2.1 样本固定

· 目的

1) 充分保存细胞成分，包括可溶性和结构性蛋白质；
2) 防止细胞成分(包括抗原和酶)自溶和置换；
3) 稳定细胞材料，避免后续程序产生有害影响；
4) 便于常规染色和免疫染色[1]。
甲醛是常规组织学和免疫组织化学固定剂的金标准。甲醛主要保存肽和细胞器的一般结构。
<hr/>· 基本步骤：

1）取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透。
2）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或 PBS 进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质。
3）固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液包括 10% 中性缓冲福尔马林 (Formalin，也称为甲醛)、甲醇、乙醇或它们的混合液等。固定液的量通常为组织体积的 10-20 倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。
☑ 固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温 18-24 h。
4）固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。
<hr/>注意事项：

• 固定的时间不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失。
  
• 固定的温度通常为室温或 4°C，避免高温导致组织损伤。
  
• 在固定过程中，要确保组织样本完全浸入固定液中，避免出现未固定的部分。
  
• 固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。
  

<hr/>2.2 包埋

· 目的

保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。通过将组织样本嵌入到固体介质中，可以制作出适合在显微镜下观察的薄切片。
常用的包埋介质包括石蜡、树脂等。石蜡包埋是免疫组化中最常用的方法，因为它可以有效保存组织形态，提升切片质量。树脂包埋则常用于需要更高分辨率或特殊染色方法的样本。

· 基本步骤：

1）脱水：在组织样本固定后，需要将其中的水分去除，以便于包埋介质能够充分渗透。酒精梯度脱水: 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇 (I)、无水乙醇 (II) 分别浸泡 1 min。
2）透明：脱水后，组织样本会变得不透明，需要使用透明剂（如二甲苯）来去除其中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明。通常用二甲苯浸泡两次，每次浸泡 1min。
3）浸蜡：将透明后的组织样本放入熔化的石蜡中，让石蜡充分渗透到组织样本中。这个过程通常需要在温箱中进行，以确保石蜡的均匀渗透。
4）包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。这样，组织样本就被包埋在石蜡中了。

· 注意事项：

• 在包埋过程中，要控制好温度和时间，以确保石蜡的均匀渗透和组织的完整性。
  
• 包埋后的组织块需要冷却凝固后才能进行切片。在冷却过程中，要避免过度冷却导致石蜡碎裂或组织变形。
  
• 在包埋前，要对组织样本进行充分的固定和脱水处理，以确保其抗原性和完整性。
  

<hr/>2.3 切片

· 目的

将包埋后的组织样本切割成薄片，以便于在显微镜下观察和检测。

· 基本步骤：

1）切片前的准备：确保包埋后的组织块已经充分冷却并固化。使用适当的切片机进行切片。
2）切片：将包埋好的组织块固定在切片机的样本夹上。调整切片机的切片厚度，通常为 4-5 微米厚，这个厚度是根据需要检测的抗原和实验要求来确定的。
3）展片：使用刷子或毛笔轻轻地将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水 (40℃) 中展开。
4）烤片：60℃ 烤片 2 h。

· 注意事项：

• 在切片过程中，要控制好切片机的速度和切片刀的锋利度，以获得高质量的切片。
  
• 切片后，要及时对切片进行处理，以避免抗原的损失和组织的变性。
  
• 使用适当的黏贴剂，确保切片牢固地附贴在载玻片上，以便于后续的免疫组化实验。
  

<hr/>2.4 脱蜡水化


· 目的
将组织切片从石蜡中释放出来，并使其恢复到适合进行后续抗原检测和染色的状态。

· 基本步骤：
1）脱蜡：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡。通常，这个过程会分为多个步骤，每步大约持续 5 分钟，以确保石蜡被完全去除。例如，可以使用二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 和二甲苯 Ⅲ 分别浸泡 5 min。
2）水化：依次置于无水乙醇 I、无水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入纯化水中清洗浸泡 5 min。

· 注意事项：

• 彻底脱蜡：脱蜡过程必须彻底，以确保石蜡被完全去除。否则，残留的石蜡会影响后续的抗原检测和染色。
  
• 避免干燥：在整个脱蜡水化过程中，应确保切片始终保持在湿润的状态，避免干燥。干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。
  

<hr/>2.5 抗原修复

· 目的

重新暴露或修正这些被封闭或扭曲的抗原，以提高免疫组化实验中的抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性[3]。
最常用的修复缓冲液是 10 mM 的 pH 6.0 枸橼酸钠、pH 9.0 的 Tris-EDTA 、pH 8.0 的 EDTA。建议测试多种方法以寻找染色效果最佳的方法。

· 抗原修复的方法：

(1) 微波热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火 8 min，停火 7 min，转小火 8 min；取出染色盒，冷却至室温。
(2) 水浴热修复: 加入抗原修复液，放入切片，置于水溶锅中加热，其间不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效度 (92℃)，维持 40 min 后取出染色盒，冷却至室温。
(3) 高压热修复: 在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热 5 min，关闭电源，10 min 后取出染色盒，冷却至室温。
(4) 酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解 (通常为 37°C，20 min)。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。

· 注意事项：

• 加热后需自然降温；
  
• 使用过量的抗原修复液；
  
• 修复液的不同 pH 值对染色结果的影响比较大；
  
• 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。不同的抗体可能需要不同的抗原修复方法和条件，因此需要根据实验要求和抗体特性选择合适的抗原修复方法。
  

<hr/>2.6 灭活

· 目的

消除细胞或组织中内源性酶和活性物质的影响，降低背景噪音，提高实验的特异性和敏感性[4]。
(1) 灭活内源性过氧化物酶：HRP 检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是 3% 过氧化氢水溶液，室温 10 min。
(2) 洗涤：用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片、浸泡 2 次，5 min/ 次。

· 注意事项：

• H2O2 需现用现配，且 4℃ 避光保存，否则易引起非特异背景。
  
• H2O2 孵育时间过长也会易引起脱片。
  
• 部分组织还含有内源性碱性磷酸酶，可用左旋咪唑进行灭活。
  

<hr/>2.7 封闭


· 目的
封闭组织切片上非特异性结合位点，防止抗体与这些位点结合，从而减少背景信号。

· 基本步骤：
1）非特异位点封闭：将封闭液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到组织切片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。然后将切片放入湿盒中，在室温或 37°C 下孵育 30 min，让封闭液与组织切片充分作用。
2）洗涤：封闭结束后，用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。
<hr/>2.8 一抗孵育

免疫组化中的一抗孵育是免疫组化实验的关键步骤之一。

· 基本步骤：

1）选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗。一抗应该与目标抗原的种属来源、类型等相匹配。
2）稀释一抗：根据一抗的效价和实验要求，用适当的稀释液 (如 PBS、TBS 等) 稀释一抗。
3）涂覆一抗：将稀释好的一抗均匀涂覆在已封闭的组织切片上，确保抗体能够充分接触组织切片上的抗原。
4）孵育：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的组织切片上，放入湿盒中，室温 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗与抗原充分结合。

· 注意事项：

• 确保一抗的质量和特异性，避免使用过期或质量不佳的一抗。
  
• 充分洗涤组织切片，去除未结合的一抗和其他杂质，减少背景染色。
  

<hr/>
2.9 二抗孵育

二抗的作用是与一抗结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，从而增强信号的强度和特异性。
在免疫组化实验中，二抗通常带有标记酶(如 HRP.AP 等)，这些标记物在后续的显色步骤中可以产生可见的染色信号，便于在显微镜下观察目标抗原在组织中的分布和表达情况。

· 二抗孵育的基本步骤：

1) 稀释二抗：参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗。
2) 孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育 30 min-60 min。
3) 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液 (如 PBST 或 TBST) 在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤通常需要重复几次，每次洗涤时间一般为 5-10 分钟。‍‍‍‍‍‍

· 注意事项：

二抗的选择和稀释比例应根据实验的具体要求和一抗的特性来确定。
对于抗体的选择还有疑惑的小伙伴可以翻翻小 M 的往期推文：官宣! MCE 迎来了一位新成员——抗体
<hr/>2.10 显色

显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂。HRP-DAB 是最常用的显色剂组合。
原理：在免疫组化中通常使用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等作为标记酶。这些酶能催化底物发生颜色反应，从而在抗原所在的位置形成可见的沉淀物。

· 基本步骤：

1）加入酶的底物 (如 HRP 的底物为 DAB，AP 的底物为 BCIP/NBT)。
2）底物在酶的作用下发生化学反应，形成有色沉淀物，通常呈现棕色 (对于HRP-DAB 系统) 或蓝色 (对于 AP-BCIP/NBT 系统)。
3）通过显微镜观察组织切片上的颜色变化，可以确定抗原在细胞或组织中的位置和表达水平。

· 注意事项：

• 选择适当的检测系统：根据实验目的和样本特性选择合适的检测系统；
  
• 优化条件：对一抗、二抗的浓度、孵育时间和温度等条件进行优化，以获得最佳的检测结果。
  
• 注意防护：DAB 为联苯偶氨化合物，可诱发皮肤癌和膀胱症，在显色操作过程中需注意防护。
  

<hr/>2.11 复染

为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可进行复染[5]。
复染：滴加 80-100 μL 苏木素染色液至完全覆盖组织，室温孵育 5 min，自来水冲洗返蓝。

· 注意事项：

• 复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。
  
• 如果染色过浅可重复染色，如果染色过深可使用盐酸进行分化。
  

<hr/>2.12 封片观察

在免疫组化实验中，封片观察是最后的步骤，用于保护组织切片、增强对比度和稳定性，并允许在显微镜下进行长期观察和分析。

· 封片步骤：

1）脱水：在完成所有染色步骤后，通常需要将组织切片进行脱水处理，以去除切片上的水分。切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、无水乙醇 I、无水乙醇 Ⅱ 分别浸泡 1 min。
2）透明：脱水后，切片需要进行透明处理，以便封片剂能够均匀分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡两次，每次 1 min。
3）封片：将一滴封片剂 (如中性树胶、甘油明胶等) 滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖。封片剂的选择取决于实验要求和标本类型。封片时要确保没有气泡产生，并且盖玻片与切片之间紧密贴合。
4）干燥：让封片剂自然干燥，或者可以在温箱中加速干燥过程。干燥后的切片可以长期保存，并随时用于观察。

· 注意事项：

• 封好的切片可以长期保存，但应放置在干燥、避光、温度适宜的环境中，以避免切片受潮、褪色或损坏。
  
• 封片剂和某些化学试剂可能对人体有害，因此在进行封片操作时要注意安全防护措施，如佩戴手套、眼镜等。
  

<hr/> 3 IHC 常见问题及解决方案

Q1：染色弱？

实验过程中，我们常会遇到染色较弱的情况，如下图所示：




图 4. 染色弱。

可能性原因：
1）抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，延长孵育时间；
2）检查试剂是否超过有效期；
3）检查标本固定方式、抗原修复方式是否适合目标抗原；
4）未沥干切片水份，致使试剂稀释。建议滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(注意防止切片干燥)；
5）孵育温度过低，若室温低于 15℃，要改放在 37℃ 孵育箱孵育 30-60 min (或 4℃ 冰箱过夜)。

Q2：产生非特异性染色？

在使用检测进行诊断之前，必须了解反应在细胞或组织内的预期抗原分布。如下图所示，CD79a 抗体仅染色了浆细胞瘤细胞的细胞核。根据目前对该抗原位置(细胞质和细胞质膜) 的了解，该反应被认为不是特异性的。
注：非特异的原因也有是因为修复方式不对，可能是修复太强了。




图 5. 非特异性染色[6]。

下部插图是异常染色的细节；上部插图描绘了浆细胞瘤中 CD79a 的典型细胞质染色。条 = 60 μm，两个插图条 = 5 μm。

可能性原因：
1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高 (含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4）非特异性组分与抗体结合，需延长封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5）DAB 孵育时间过长或浓度过高；
6）洗涤不充分，可增加洗涤次数和洗涤时间；
7）染色过程中出现干片。干片容易导致非特异性染色，实验过程中需避免干片。

Q3：免疫组化染色呈阴性结果的原因？





图 6. 免疫组化阴性染色。

可能性原因：
1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误，重新确认抗体信息；
2）确认试剂是否遗漏，添加顺序是否正确；
3）抗原修复条件不合适，摸索最合适抗原修复条件；
4）组织切片本身这种抗原含量低，建议用已知阳性样本作阳性对照。

Q4：背景强？





图 7. 免疫组化染色背景强。  

可能性原因：
1）检查一抗和二抗浓度过高，需摸索合适的抗体浓度；
2）是否有效去除内源性酶和生物素，可延长内源性酶灭活时间；
3）血清封闭时间是否过短，可延长封闭时间；
4）检查一抗的特异性是否良好，选择特异性高的抗体；
5）适当增加抗体孵育后的洗涤次数和延长洗涤时。
<hr/>相关产品


IRF3 Antibody
IRF3 Antibody 是一个非偶联、兔源、抗 IRF3 单克隆抗体。它可用于人、小鼠背景下 WB、ICC/IF、IHC-P、FC 实验。
Ki-67 Antibody该抗体是一个非偶联、兔来源、抗 Ki-67 多克隆抗体。同时是直肠癌、宫颈癌等免疫组化检查指标之一。可用于人、小鼠、背景下的 WB, ELISA, IHC-P, IHC-F, Flow-Cyt, ICC, IF 实验

p16 Antibody该抗体是一个非偶联、兔来源、抗 p16 单克隆抗体。它是宫颈癌等免疫组化检查指标之一，可用于人背景下 WB, IHC-P 实验。

p53 Antibody该抗体是一个非偶联、兔源、抗 p53 单克隆抗体。它可用于人背景下 WB、ICC/IF、IHC-P、IP 实验。

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG H&L该抗体是偶联了 HRP 标记、山羊来源的抗小鼠 IgG 抗体。它可结合小鼠 IgG 抗体的轻链和重链，用于小鼠背景下 WB、ELISA、IHC 实验。

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG H&L
该抗体是偶联了 HRP 标记、山羊来源的抗兔 IgG 抗体。它可结合兔 IgG 抗体的轻链和重链，用于兔子背景下 WB、IHC-P、ELISA 实验

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务。
<hr/>参考文献：

[1] Ramos-Vara JA,et al. When Tissue Antigens and Antibodies Get Along: Revisiting the Technical Aspects of Immunohistochemistry—The Red, Brown, and Blue Technique. Veterinary Pathology. 2014;51(1):42-87.
[2] Amereh M,et al.Immunohistochemistry (IHC) staining of in-vitro cancer cell-generated tumoroids. MethodsX. 2023 Jun 3;10:102242.
[3] Shi SR,et al.Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741-8.
[4] Hussaini HM,et al.Immunohistochemistry and Immunofluorescence. Methods Mol Biol. 2023;2588:439-450.
[5] Mebratie DY,et al.Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives. Semin Diagn Pathol. 2024 May;41(3):154-160.
[6] Ramos-Vara JA, et al. Suggested Guidelines for Immunohistochemical Techniques in Veterinary Diagnostic Laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2008;20(4):393-413.

继续前进

一、脱蜡水化：
切片在脱蜡前，放在APES（防止脱片用的，缺点是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干或60°C恒温箱中烘烤20分钟，然后将组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min，无水乙醇浸泡 10min，更换无水乙醇再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，最后用蒸馏水浸泡
5min；
原理：
①二甲苯的作用：溶解蜡块，起到脱蜡的作用；
②梯度酒精是为了除去对人体有害的二甲苯，但高浓度的酒精时间过长会导致组织细胞变形，影响抗原的表达，也会影响到组织在显微镜下的光学形态，所以用梯度酒精；
③保持玻片在自来水中，直到准备进行抗原修复。任何时候都不应该使玻片干燥，干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色；
技巧：
①观察是否脱蜡完全，因为石蜡是不溶于水的，如果石蜡脱不完全，水流上去会模糊还有滞流感。原则就是彻底、干净、完全的脱去石蜡。
二、清洗：先用用蒸馏水温柔的冲洗一会，更换PBS冲洗5min，再用PBS冲洗5min；
注意：冲洗时尽量温柔，可以多冲洗一会；
①可以将玻片放在卧式缸里，在摇床上轻轻晃3-5min,重复2-3次
三、抗原修复：（此步骤根据实验可增减）
将切片放入盛有0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续 10~15分钟取出容器，室温冷却30分钟；
注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型；
原理：
①枸橼酸缓冲液，是抗原修复液的一种，一部分抗体使用这种修复液修复的效果最好。
②对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须经过抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加抗原检测率。修复的方法有很多种，我采用的是热修复。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
③修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种我们这次实验用的枸橼酸缓冲液，此外还有EDTA缓冲液。（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。
四、消除内源性过氧化物酶的活性
用3%H2O2滴加到切片上，封闭5-10min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2-5min，冲洗三次。
特别说明：在一些过氧化物丰富的组织里面（肝脏、胎盘、血管瘤、急性炎症组织等）3%H2O2
也不能完全消除内源性的过氧化物，改进的方法就是先用3%H2O2阻断10min,再用0.5%的高碘酸溶液阻断10min。
五、封闭：用和二抗来源一致的血清在保湿盒中于37℃孵育15~30min，然后甩去封闭用血清，勿洗；
注意：封闭时间根据具体实验调整；封闭液一般选用5%BSA或与二抗来源一致的血清，切记是BSA，不是PBS.很多论坛写的是PBS,太坑了。
①使用血清好还是BSA好？
答：第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。
第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。
六、一抗孵育：
滴加适当比例稀释的一抗，将切片放在保湿盒中于4℃冰箱中过夜孵育或者温箱37℃孵育1-2个小时。
小技巧：一抗孵育可以是4℃冰箱中过夜孵育，也可以选择37℃孵育1-2小时。关键就是温度要控制恒定。普遍情况下都选择4℃冰箱中过夜孵育，因为它的温度稳比室温要稳定。
注意：适当比例稀释是可以查到的，很多说明书或该公司网站产品详情页都有，实在不行你直接打电话去问公司的技术支持，他们给的建议更适合他们的产品，可别想当然。
七、清洗：过夜后的切片用PBS冲洗，冲洗3次；
注意：一定要单独冲洗，多个片子防止交叉反应造成污染；温柔冲洗，防止切片的脱落
八、二抗孵育：
滴加生物素标记的二抗在保湿盒中于37℃孵育30分钟。加之前吹干净标本上的水（可以用吸水纸沿着材料周围画圈把水吸干）
注意：其实抗体孵育过程都是一致的目的都是结合，所以一定要保证在一个环境稳定和稳定恒定的条件下进行，你也许会在实验室发现一个大纸条写着实验中，勿动！
九、清洗：切片用PBS冲洗2min，冲洗3次；
十、滴加适当比例稀释的HRP标记的亲和素，再37℃孵育20min
十一、清洗：用PBS冲洗2min，冲洗3次
十二、显色：加入显色剂显色，选择DAB（快速滴入，观察染色情况）根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在3-10min左右，最常用5min。
十三、自来水冲洗：自来水充分冲洗10-15min,
注意：冲洗的时候要注意水流不要太大，缓慢的冲洗。
十四、复染：加一大滴苏木精复染，细胞核蛋白几秒就可以，细胞浆或者细胞膜蛋白需要然20-30S，自来水冲洗，再用PBS返蓝5min。
注意：
①复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。如果是第一次做，可以请教一下实验室的老师问一下经验，自己在多备两个片子，摸索感受一下。
②若试验目的只是想说明组织中蛋白表达的有无、量的多少和颜色的深浅，那就不需要苏木素复染；若实验目的是想看组织切片蛋白定位在胞核还是胞浆，那就最好苏木素复染；
③复染试剂的选择与显色系统相关联？如果是AEC和DAB系统，那么显色应该是红色和棕黄色，这样你用苏木素复染核就不会影响阳性细胞的观察，更何况你所检测的抗原位于胞浆中呢。如果你用BCIP/NBT系统显色，则显色为紫黑色，此时你复染核就不能用苏木素了，因两者的色泽相似。你可以选用甲基绿溶液复染核，这样核为鲜艳的兰绿色，不容易与BCIP/NBT系统相混淆了。
④关于返蓝的选择，我估计大家看到很多不同选择（有水、氨水、PBS、饱和碳酸锂等等）。本质来说，返蓝的原理是苏木素遇碱变蓝色，所以以上这几种都是偏弱碱性的物质。
十五、脱水透明
依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，最后用100%酒精浸泡10min，更换酒精浸泡10min，最后用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯，再浸泡10min；
注意：梯度酒精的作用：脱水，以便片子长期保存；二甲苯是为了使片子更加透明；
十六、封片
捞出，用树脂封片，一滴/张,在其上盖上小玻片
封好的组织切片，放入超净台中，打开抽风，冲一段时间，最后把切片放在窗台上凉2-3天，就可收起来。
注意：封片用的材料与显色系统相关：DAB显色的石蜡切片免疫组化封片用中性树脂或者中性快干胶都可以啊，AEC显色的用水溶性的封片剂就可以，免疫荧光的话需要专门的防脆变的封片剂或者用甘油也行（但是保存时间很短）。
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大力水手

干货分享 | 5分钟掌握免疫组化实验

同花顺

（1）固定：最好用 4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；
但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推
荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S 固定液：饱和苦味酸 750ml，甲醛 250ml，冰醋酸 50ml，其对组织的穿透力
较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织
标本的长期保存。
PLP 液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超
微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
（2）组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
（3）切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴
乙醇。
（4）烤片：60℃ 30 分钟或 37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。（5）蜡块及切片的保存：最好在 4℃保存
（6）脱片问题：
Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml
的多聚赖氨酸溶液可按 1:10 稀释成 60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压
的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES 和 Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条
件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在 APES 1：50 丙酮溶液中浸泡 3
分钟，晾干，即可进行下一步。
（7）灭活内源性酶：HRP 系统：3%双氧水灭活；AP 系统：3%HAc 灭活。
（8）暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将
有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体
说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热
修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
（9）封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血
清封闭
（10）抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于 PBS 稀释的抗体一定要当天使用。
（11）背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，
可采用含 1‰ Tween20 的 PBS 洗，特别是在显色之前要多洗。
（12）返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如 PBS）或 Na2HPO4 的饱和溶液
返蓝。
（13）显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
（14）在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。