荧光原位杂交技术

生物科研实验室

一、荧光原位杂交技术原理荧光原位杂交技术是根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记DNA或者ＲNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况［1］。原位杂交技术最早由Pardue和Gall、John于1969年建立［2］，他们将放射性标记的 DNA与目标DNA接合，通过放射自显影技术来确定目标基因所在位置，首次做到了在细胞完整的条件下检测细胞内基因［2］。但是存在灵敏度和分辨率不能同时都满足的缺点，所以人们开始了改进探针和杂交方法的探索。1981年，Boumam和Langer等首次采用荧光素标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术［3］。1988年，Giovannoni 将原位杂交技术引入细菌学的研究，使用rＲNA探针显微探测细菌［4］。随着更安全的荧光技术的发展，1989年Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞［5］。二、杂交所用的探针分类杂交所用的探针大致可以分类三类：
1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。三、探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。四、与其他杂交技术进行综合比较发现，荧光原位杂交技术（FISH）具有一些优势1、循环周期短，稳定性高，非常安全；分辨率高，为3～20 Mb；2、探针能较长时间保存；3、多色标记，简单直观；4、在荧光显微镜下在同一切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到其相对序列和位置，从而大大加速生物基因组和功能基因组定位的研究。