流式细胞术的应用

生物科研实验室

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种可在细胞或分子水平，对单细胞和亚细胞结构进行快速检测、分析或分选的多功能生物技术。由于其具有可对大量细胞进行高通量检测、可对单个细胞进行多参数分析，和能够同时进行细胞分析和细胞分选等优势，FCM在生物医学基础研究和临床研究中得到了广泛应用。FCM在20世纪50年代被首次提出，并在此后得到快速发展和广泛应用，这得益于生物样品液流技术、细胞分选计数技术以及计算机数据采集与信号分析等技术的进步。1953年，Crosland-Taylor［2］设计了生物样品流动室的基本结构，奠定了液流技术的基础。1956年，Coulter等经过多年的探索研发出Coulter计数器，可利用电脉冲信号无接触地检测细胞数量和尺寸。1973年，Steinkamp等［3，4］建立了基于细胞荧光标记和激光激发检测的快速分析技术。 上述三种技术经过深入的发展和融合，并结合了计算机科学、激光科学和纳米药物科学等领域的最新成果，产生了现代FCM技术。在传统FCM中，研究人员将单个细胞或微粒在液体中形成单个流动的细胞流，通过激光束照射，使样品中的细胞或微粒发射荧光，利用荧光信号和散射信号来区分和分析不同类型的细胞或微粒［5-7］。FCM的可进行快速定量分析流体系统中单个颗粒多参数性能的能力，使其在细胞群体检测领域发挥着不可替代的重要作用，并且在免疫功能、细胞周期和DNA分析、干细胞、抗体开发、疫苗评价、细胞增殖和细胞生理功能的科学研究中也有着巨大的应用价值［8，9］。

流式细胞术的应用场景一、免疫分型
免疫分型在流式细胞术的应用中最常见，它利用流式细胞术的独特能力同时分析混合细胞群的多个参数。免疫分型最基本的形式就是使荧光偶联抗体与细胞表面对应的抗原特异性结合，之后利用流式细胞仪，根据细胞表面的荧光对细胞做出分析。二、胞内因子检测胞内细胞因子检测通常使用蛋白转运抑制剂（Brefeldin A或Monensin）处理细胞2-12小时，使细胞产生的各种细胞因子在胞内积累，便于更好地检测。在这个处理过程中，细胞可以被各种抗原刺激，以检测细胞的免疫反应。在蛋白质转运抑制剂处理完毕后，对细胞进行活力标记和细胞表面标记染色，之后进行固定和渗透，以使细胞因子抗体进入细胞内染色。三、细胞凋亡检测流式细胞术利用与凋亡相关的级联事件的靶点进行细胞凋亡检测：膜联蛋白 V（Annexin V）靶向易位的细胞质膜进行染色；TUNEL（TdT dUTP Nick End Labeling）靶向内切酶消化的DNA进行标记；抗体和染料靶向半胱天冬酶（Caspases）的激活；确定线粒体膜电位的染料靶向线粒体凋亡；Hoescht 33342靶向细胞核中的染色质凝聚。四、细胞增殖检测生物医学工程：在生物医学工程领域，原代细胞可用于生物传感器、生物芯片等产品的开发。这些产品具有高度的灵敏度和特异性，可以应用于疾病诊断、环境监测等领域。五、荧光蛋白检测荧光蛋白(GFP、mCherry、YFP、mRuby等)常被用作蛋白质表达的标记，即细胞被转染含有启动子序列、目的基因序列和荧光蛋白序列的质粒。当目的基因表达产生目的蛋白时，其下游的荧光蛋白基因共同表达，从而使细胞发出荧光信号。该技术应用于多种研究，例如在体内追踪移植细胞，检测细菌或病毒感染，以及鉴定基因功能等。六、细胞周期检测细胞周期检测使用饱和量的DNA结合染料对DNA进行染色。在大多数情况下，使用70%乙醇溶液固定细胞，使细胞通透，然后使用染料（PI, 7AAD, DAPI）染色。当然，也可以使用破膜剂对细胞进行处理，直接对活细胞进行周期检测。七、细胞分选细胞分选利用流式细胞分选仪来分离纯化细胞或颗粒以供进一步分析。基本上，任何具有荧光的细胞或颗粒都可以被分选。细胞可以被分选到96孔板、384孔板、管中和载玻片上。常见的样本有表达荧光蛋白的转染细胞、干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞和白细胞群。细胞分选需要考虑的一个主要因素，是对大量细胞进行染色时，增加所需的抗体量。