高分辨质谱仪Orbitrap Astral在蛋白质组学中的应用

空白派

2023年6月，赛默飞隆重推出了基于全新质量分析器的Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™高分辨质谱仪，该质谱仪一经发布，就引起了业界的广泛关注。Orbitrap Astral质谱分析仪在Exploris 480的基础上，集四极杆质量分析仪、Orbitrap质量分析仪、Astral质量分析仪于一体，完美融合三大质量分析器，能够快速获取高质量、高分辨率、高灵敏度和宽动态范围的精确质量（HRAM）数据，最大限度提升解决方案的性能和可用性。伯远生物作为一站式基因功能研究的引领者，率先引进了华中地区首台Orbitrap Astral高分辨率质谱仪，搭建了 “表观组-转录组-蛋白组-代谢组”四位一体的多组学平台，以期为科研人员提供更全面、更高水准的多组学服务以及更完善的一站式CRO服务！
Orbitrap Astral在蛋白质组学中的应用案例
案例一
2023年10月6日，华盛顿大学基因组科学系Michael J. MacCoss教授团队在Journal of proteome research（IF：4.4）上发表了题为“Evaluating the Performance of the Astral Mass Analyzer for Quantitative Proteomics Using Data-Independent Acquisition”的研究性论文。在本研究中，团队通过使用数据独立采集技术评估了Orbitrap Astral质谱仪在定量蛋白质组学中的性能，结果发现Astral质谱仪每单位时间定量的肽比Thermo Scientific Orbitrap质谱仪（长期以来一直是高分辨率定量蛋白质组学的黄金标准）多5倍，并且Orbitrap Astral质谱仪可在宽动态范围内产生高质量的定量测量（图1）。



图1 Orbitrap Astral MS定量性能评估（Heil et al., 2023）。

同时，在血浆样品的检测中团队开发了一套全新的处理方案，使用基于磁珠的方法从血浆中富集覆膜颗粒组分，经处理后的样品，使用Orbitrap Astral高分辨质谱仪在60分钟梯度内定量超过5000种血浆蛋白。说明Orbitrap Astral高分辨质谱仪非常适合鉴定血浆这类高动态范围的样品，并且，其可在动态范围非常宽的样品中检测到更多的生物标志物（图2）。



图2 Orbitrap Astral高分辨质谱仪在血浆蛋白定量鉴定中的测试（Heil et al., 2023）。

案例二
2024年3月22日，美国加利福尼亚州洛杉矶雪松西奈医学中心Jennifer E Van Eyk教授团队在bioRxiv（预印本）上发表了题为“Paradigm shift in biomarker translation: a pipeline to generate clinical grade biomarker candidates from DIA-MS discovery”的研究性论文。在本研究中，团队创建了靶向提取定量评估（TEAQ）软件包，可自动从DIA-MS数据中选择符合可靠性、可重复性、线性和精确度严格标准的原型特征肽。团队通过使用Orbitrap Astral MS鉴定血浆样本，证明可以从DIA-MS数据中识别特征肽。详细而言，团队通过DIA-MS使用混合消化人血浆样品评估了Orbitrap Astral MS平台在三种不同通量下的性能，并将其与之前发布的Orbitrap Exploris™ 480 MS及Evosep One联用使用相同血浆获得的数据进行了比较。结果发现Orbitrap Astral MS在所有样品通量协议中均表现出色，与之前发布的同一混合血浆样本的Exploris 480 MS数据集相比，Orbitrap Astral MS表现出优异的灵敏度、重现性和完整性，鉴定出1.7倍以上的蛋白质，且中值CV更低（图3）。



图3 评估Orbitrap Astral MS血浆蛋白质组性能的工作流程（Fu et al., 2024）。

案例三
2024年3月7日，巴黎萨克雷大学医药与健康技术系Jean Armengaud教授团队在Microbiome（IF：15.5）上发表了题为“Evaluating the Performance of the Astral Mass Analyzer for Quantitative Proteomics Using Data-Independent Acquisition”的研究性论文。在本研究中，团队旨在通过分析生物系统中的主力蛋白质，元蛋白质组学使我们能够列出任何微生物群中存在的分类群，监测它们的相对生物量，并描述复杂生物系统的功能。团队首次展示了利用Orbitrap Astral从真实的宏蛋白质组学样本中获得的结果，即在单个微生物样本中，通过90分钟DIA分析识别和量化了44204个蛋白质组，控制FDR搜索为1%，与迄今为止我们所知的关于真实元蛋白质组样本的所有报告相比，这是一个突破性的数字。一旦在分析程序的所有阶段进行了特定的优化，这个值将来会更高。在30分钟的DIA运行中涵盖超过122000个独特肽和38000个蛋白质组，同时在分析运行中保持非常好的可重复性，这种能力也是非常有希望的（图4）



图4 本文部分鉴定结果（Dumas et al., 2024）。

Orbitrap AstralvsOrbitrapExploris 480
上文，小医已经向大家分享了一些Orbitrap Astral在蛋白质组学中的实际应用，相信大家已经对Orbitrap Astral的功能有了一定的了解，下面，小医对Orbitrap Astral与 Orbitrap Exploris 480进行了比较，方便大家选择。
从前面的介绍中，不难看出，Astral是Exploris 480的升级版，其遥遥领先的优点包括：更高的样本检测通量、前所未有的蛋白鉴定深度、超高灵敏度、更精准的定量、更高的仪器稳定性与重现性。2023年8月29日，Daniel Hornburg教授团队在bioRxiv（预印本）上发表了题为“Protein Coronas on Functionalized Nanoparticles Enable Quantitative and Precise Large-Scale Deep Plasma Proteomics”的研究性论文。在本研究中，团队主要研究了利用功能化纳米粒子（NP）通过电晕效应形成蛋白“冠”来实现定量和精确的大规模深度血浆蛋白质组学研究。团队研究了使用深度血浆蛋白质组学工作流程与Orbitrap Exploris 480及Orbitrap Astral仪器结合使用时的倍数变化准确性、线性、精密度和统计功效。结果表明使用Orbitrap Astral基于NP的工作流程能够准确识别血浆中6000多种蛋白质（错误发现率为1%），与仅限于检测数百种血浆蛋白质的黄金标准纯血浆工作流程相比，NP有助于以准确的倍数变化、高线性和精度定量更多蛋白质（图5）。



图5 本文研究概述（Huang et al., 2023）。

   通过自动化的NP工作流程与全新的Orbitrap Astral检测器结合，能够进行高通量、深度和定量的血浆蛋白质组学研究，并具有足够的能力以肽水平分辨率发现新的生物标志物特征，为发现大量新的biomarker铺平道路。
   2023年6月6日，丹麦哥本哈根大学Jesper V. Olsen教授团队联合赛默飞在bioRxiv（预印本）上发表的题为“Narrow-window DIA: Ultra-fast quantitative analysis of comprehensive proteomes with high sequencing depth”研究性论文展示了Orbitrap Astral的优越性，其研究结果如下：
（1）Orbitrap Astral MS可实现窄窗口DIA，隔离宽度与DDA分析相当。
（2）全覆盖蛋白质组的短梯度极致探究，过去酵母蛋白质组1h极致结果是4000个蛋白，而Astral高分辨质谱8min梯度即可得到4100个蛋白，上机梯度15min以后可达到4500个蛋白。人293T细胞在Astral高分辨质谱1h上样量2μg时可达到9879个蛋白，且即使是上样量减少到100ng时仍能覆盖88%的蛋白（图6）。



图6 酵母和人293T细胞的上机分析结果（Guzman et al., 2023）。

（3）根据前体m/z对微量样本窗口位置进行系统梯度优化；
（4）提高无标记定量的定量精度和准确度，Orbitrap Astral MS能够在28min梯度中识别超14000种蛋白质和超260000种肽前体，Orbitrap Exploris 480 MS在45min梯度中只能鉴定约7000种蛋白质和约76000种肽前体（图7）；



图7 使用Orbitrap Astral MS提高LFQ准确度和精确度（Guzman et al., 2023）。

（5）快速多次采集策略以获得深度蛋白质组；
（6）超快速窄窗口DIA助力系统生物学和临床蛋白质组学分析，如：DIA 3Th 180SPD方法应用到酵母突变体的系统生物学评价，DIA 3Th 180SPD方法应用到酵母突变体的系统生物学评价。由于篇幅有限，本文不再详述实验结果，感兴趣的同学可自行下载文献，进行深入解读。
参考文献
Dumas T, Martinez Pinna R, Lozano C, et al. The astounding exhaustiveness and speed of the Astral mass analyzer for highly complex samples is a quantum leap in the functional analysis of microbiomes[J]. Microbiome, 2024, 12(1): 46.
Fu Q, Vegesna M, Sundararaman N, et al. Paradigm shift in biomarker translation: a pipeline to generate clinical grade biomarker candidates from DIA-MS discovery[J]. bioRxiv, 2024: 2024.03. 20.586018.
Heil L R, Damoc E, Arrey T N, et al. Evaluating the performance of the Astral mass analyzer for quantitative proteomics using data-independent acquisition[J]. Journal of proteome research, 2023, 22(10): 3290-3300.
Huang T, Wang J, Stukalov A, et al. Protein Coronas on Functionalized Nanoparticles Enable Quantitative and Precise Large-Scale Deep Plasma Proteomics[J]. bioRxiv, 2023.
Guzman U H, Martinez del Val A, Ye Z, et al. Narrow-window DIA: Ultra-fast quantitative analysis of comprehensive proteomes with high sequencing depth[J]. BioRxiv, 2023: 2023.06. 02.543374.

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