基于玻璃基底的细胞培养芯片研究（下）

微流控芯片

1.3细胞培养装置及细胞培养

将加工完成的芯片与温度控制系统、进样系统、信号检测系统等整合成一个完整的细胞培养微系统，并在此微系统内培养PIEC。通过微量注射泵供给培养液,通过荧光显微镜完成信号检测。

2.1.1  ITO玻璃的腐蚀 在传统的玻璃微流控芯片制作工艺中，通常采用石英玻璃作为基质材料,但其价格较为昂贵,制作工艺复杂，且刻蚀速率较慢，需要长时间的刻蚀才能获得足够的深度。为此,通常需要在玻璃表面沉积一层薄膜材料作为刻蚀掩模层，如氧化硅、氮化硅、多晶硅和金属层。这些问题的存在极大地限制了玻璃在微流控芯片加工领域的应用。在此,我们采用商品化的ITO玻璃作为制作细胞培养芯片的基质材料。ITO玻璃是钠玻璃的一种，其所含的Na,O,CaO、MgO等杂质成分可以大大加快玻璃湿法腐蚀的速度。同时,为了简化制作工艺,降低成本，采用光刻胶AZ4620作为刻蚀掩模层;腐蚀液则采用1B稀释的BOE液,最大刻蚀深度可达到110μm。如图4所示,刻蚀时间与刻蚀深度呈较好的线性关系,平均刻蚀速度为066 μm/min。

212ITO玻璃腐蚀中钻蚀效应的应用 如前所述,在设计细胞培养芯片时必须考虑培养液流动所导至的机械力影响。液体在微管道内流动所形成的剪切力除了导至细胞形态改变之外,严重时甚至可能损伤细胞。为了克服这一问题，SarunasM ichael等在芯片设计时采用栅形”结构隔离培养液进样,出样区域和细胞培养区域,有效成分通过栅形”结构扩散完成,成功实现了HeLa细胞在芯片上的培养同。在此,我们则是利用玻璃在湿法刻蚀过程中的钻蚀效应一次成型来获得坝型”结构,优化细胞培养芯片的设计。

玻璃湿法刻蚀是各向同性的，即刻蚀过程中腐蚀液不仅刻蚀掉深度方向的材料，而且几乎以同样的速度刻蚀掉侧壁的材料,我们称之为钻蚀效应。如图1(6所示,若刻蚀时间较长,宽度较小的管道壁A将被腐蚀击穿,形成坝型”结构,而宽度较大的管道壁B则未被刻穿。管道壁宽度越小,刻蚀时间越长，坝型”结构的高度越小。图5为使用台阶仪测得的坝型”结构,其掩模板为图2刻蚀深度A为39μm,“坝型”结构高度为31μm。底部D最宽为178μm培养液灌注通道的宽度C为161μm。图6为使用femlab对芯片内液体的流速模拟分析得到的结果，红色为流速较大处,蓝色为流速较小处;其中A、B幅为坝型”结构下结构图管道中部分别与进样方向平行、垂直的液体流速分布,左侧为培养液进样通道,右侧为细胞培养区域;C.D幅为没有坝型”结构的分析结果。由图6可见,使用坝型”结构可以明显降低细胞培养区域液体的流速,从而减弱流体剪切力对细胞培养的影响。

2.2细胞培养芯片与其他结构的整合

2.2.1温度控制 温度控制是细胞培养微系统的重要组成部分,培养温度若不适当,将会影响细胞的代谢和生长,甚至使细胞死亡。目前,细胞芯片微系统的加热源主要分为2类,即铜丝导电发热的间接加热方式和培养材料导电发热的直接加热方式四。为了满足长期观察和记录细胞活动的需要,我们以 ITO玻璃上的 ITO薄膜为发热材料,通过电极连入外部温度控制系统。控制系统以ADμC812单片机为硬件核心,以PID增量算法为软件控制算法,主要包括温度信号采集、放大、滤波、单片机处理和反馈控制等功能。实验过程中，温度控制目标为37℃，使用Pto00电极在芯片表面采集温度数据,上下波动小于05℃。

2.2.2 气体供应 多数细胞需要在有氧条件下生长，一种可行的供氧方法是将培养液通过氧小室，溶解氧气后再转回至细胞培养芯片内,以此满足细胞培养过程中所需要的氧气。我们采用PDMS薄膜作为芯片的盖片，除了利用它良好的生物兼容性之外，其高透气性特点还可以满足细胞培养过程中细胞对氧气的需求同,使我们在培养时不需要增加额外的气体供应装置,简化细胞培养微系统的整体设计。根据Eric等的公式计算,若芯片内细胞每秒需氧量估计值为XPDMS薄膜所能提供的氧气量每秒最大值为Fm。本实验中，X约为1.36X10"mol/s Fm约为82X10mol/s F>>X,说明采用PDMS薄膜完全可以满足细胞培养过程中细胞对氧的需求。

细胞体外培养时,除氧的供应外,一般还需要5%的CO2分压。由于本微系统未使用专门的气体供应设备,为此,我们采用改进细胞培养液的方法来满足细胞生长过程中对CO₂的需求，并提供稳定的pH值.,添加LeibovitzsL-15培养基的培养液在光照下具有高的稳定性，能够为细胞生长提供稳定的pH值,足量的NaHCO:还能满足细胞对碳酸盐的需求。

23芯片细胞培养测试

芯片用75%酒精浸泡1h取出后放入培养皿中,紫外灯照射lh。为了有利于细胞导入芯片后贴壁生长,在导入细胞之前，用注射器将培养液注入芯片内部,将芯片浸润,放置过夜,使芯片内壁包壁一层蛋白。培养液采用1640培养基,将其与L-15培养基以1：1混合后，补充10%的胎牛血清、100ug/mL链霉素。用消化液25g/L胰蛋白酶,02g/LEDTA溶液)将常规培养的PIEC消化、离心、吹打,将细胞悬浊液的浓度调整到4X10°/mm,然后用注射器吸入细胞悬浊液,通过注射泵缓慢注入芯片内。将此已导入细胞的芯片和上述温度控制系统、进样系统、视频观察记录系统相连，细胞在2~3h后贴壁生长。图7为培养72h后的细胞,其生长情况良好;图8为CCD记录的细胞贴壁过程中形态的变化。

24结语

本文介绍了一种利用ITO玻璃快速、低成本制作细胞培养芯片的方法。利用玻璃湿法刻蚀过程中的钻蚀效应,在芯片内加工出“坝型”结构,以分隔培养液进样通道和细胞培养区域,减弱了培养液灌注过程中所产生的流体剪切力对细胞生长的影响。将此芯片与透气性的PDMS薄膜键合,并整和温度控制系统、视频观察系统等,实现了PIEC在体外的培养,为下一步研究细胞迁移特性等提供了良好的基础。

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