流式细胞术的基本原理及案例分享

生物科研实验室

流式细胞术 (Flow Cytometry, FCM) 是一种在液流中快速检测细胞特性的技术。它通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞进行多参数定量分析，包括细胞表面标记、细胞内蛋白质表达、细胞周期、DNA含量等。流式细胞术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学等领域。
流式细胞术的工作原理在流式细胞仪中，细胞被包裹在鞘液 (sheath) 中，通过喷嘴以一定的速度射出。当细胞依次通过激光束时，激光束会照射到细胞并产生光信号，光信号被检测器收集并转换为电信号，再传输到计算机进行进一步处理和分析。由于每个细胞待测抗原数量不同，因此光信号的强度也不同，从而可以对每个细胞进行多参数定量分析。
光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光分为前向散射光 (forward scatter, FSC) 和侧向散射光 (side scatter, SSC) ，其强度由细胞的物理性质决定，如细胞大小、细胞内部结构复杂程度。荧光信号 (fluorescence) 由待测抗原结合荧光偶联抗体后，受到激光束的激发而产生。
流式细胞术的操作流程01样本准备样本可以来源于组织、血液或其他液体，最终均需制备成单细胞悬液，便于染色和检测。02细胞染色流式检测需要对细胞进行染色以标记特异性抗原。染色方法大体分为两类：表面抗原直染、胞内抗原染色。表面抗原直染时，细胞和荧光偶联抗体直接孵育即可；胞内抗原染色时，需进行固定和破膜后再和荧光偶联抗体孵育。03细胞洗涤在染色过程中，需要使用洗涤液对细胞进行洗涤以去除未结合的抗体和其他杂质。洗涤液一般使用预冷PBS，可选择性加入2%BSA或2%FBS以提高细胞处理中的存活率。通过洗涤可以减少非特异性结合和背景干扰，提高实验的特异性和准确性。  
04细胞固定对于胞内抗原检测，可以使用固定液（如4%多聚甲醛）和破膜剂（如0.1% Triton X-100）对细胞进行固定和打孔。固定液可以减少细胞的活性和变形，保持细胞的形态和抗原位置的稳定性。破膜剂有利于抗体进入与待测抗原结合。
流式数据获取和分析在采集期间，细胞会通过激光器激发标记物产生荧光，而这些信号会被检测器捕获。收集的数据通常以FCS(Flow Cytometry Standard) 文件的形式保存。FCS文件包含了每个细胞的多个参数的数值，例如荧光强度。通过这些数据可以了解每个细胞的特性及其分布情况。数据分析的具体步骤可能会因实验设计、数据类型和研究问题而有所不同，使用专业的流式细胞术数据分析软件，如FlowJo、CytoBank等，可以帮助简化分析流程。
案例展示（如图）