核酸提取方法学评估

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核酸是核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。核酸是生物遗传信息的贮藏场所和传递者。核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。
DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。
随着基因诊断在临床疾病的诊断和监测中发挥着日益重要的作用，基因诊断赖以完成的前提技术——核酸提取技术也有了新的进展，高效、便捷、大通量、自动化成为核酸提取技术发展的主流方向。目前临床用于核酸提取的方法主要有煮沸裂解法，TRIzol法，磁珠吸附法。


煮沸裂解法主要用于DNA的手工提取，分为一步法和两步法，一步法得到的DNA含有较多小分子抑制物。两步法师第一步在样本中加入沉淀剂后离心弃上清，以去除小分子抑制物并沉淀病毒颗粒，第二部加入裂解液后煮沸，以释放DNA及沉淀残留蛋白等大分子抑制物，离心取上清即为达到的DNA。此方法的操作相对简单，成本低，但抗干扰能力差，不利于自动化的操作。
TRIzol使样本匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制物可保持RNA的完整性。再加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA，用乙醇沉淀中间层可回收DNA，用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质，其最大特点是可同时分离一个样本的RNA、DNA、蛋白质，但由于使用有机溶剂，气味比较大。




磁珠吸附法将样本经裂解液消化后，释放出核酸，核酸与磁珠结合（特异性和非特异性），利用磁珠分离仪器将核酸提取纯化，作为后续扩增的模板。磁珠内核为氧化铁，一般应用于DNA、RNA纯化的磁珠为硅质膜磁珠，磁珠在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境中可被洗脱；或是磁珠上连有特殊设计的基团，用于对靶标核酸进行特异性的捕获，磁珠吸附法的主要优点是核酸提纯的特异性好，抗干扰能力强，容易实现全自动的核酸提取。




磁珠法不需要离心、不需要加入多种试剂，操作简单，而且自动化操作保证了实验结果稳定，避免人工操作引起的差异及错误，并很容易达到核酸提取的标准化，符合核酸自动化提取要求，是核酸纯化方法发展的一个重要方向。

关于新冠核酸提取
前些日子业内舆论繁杂，诸如“检测4次，才发现核酸阳性”、“CT结果来做确诊，不要迷信核酸”等报道层出不穷。目前国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》已更新至“试行第五版”，仍然强调核酸检测作为确诊的唯一标准。所以希望大家全心投入到全民防控疫情的焦点上来，发现问题，优化防控策略，才能让疫情的拐点更快出现。
01目前新型冠状病毒核酸检测存在的问题
目前新型冠状病毒感染的疑似病例与确诊病例已逾6万例，核酸检测需求量与日俱增。另外，湖北省增加“临床诊断”分类，将疑似病例标准放宽，需要更多保质保量的核酸检测产品投入一线应用。国家审核批准的新型冠状病毒核酸检测产品大多采取的是“实时荧光RT-PCR检测”方法，RT-PCR需要核酸提取、扩增2个步骤完成，但目前市面上部分注册产品仅有扩增产品，没有核酸提取产品，缺乏系统的核酸检测方案，无法保证核酸检测的系统性、准确性及可靠性，也间接造成了核酸检测遭到社会公众质疑的尴尬局面。因此，当检测产品投入一线后，可能还需匹配不同厂家的核酸提取试剂，对抗疫工作的开展产生了一定影响。

02提取技术是系统性核酸检测方案的关键
目前大量的新型冠状病毒核酸检测试剂投入疫情一线，但是防控效率、检测效率却未有明显提升。在央视记者采访前线检验科工作人员的报道中，也指出目前核酸提取环节存在差异，影响了检测能力的提升。

除前期的样本采集、转运、灭活等处理，核酸检测产品在检测过程中主要分为2个步骤，即核酸提取、扩增检测。扩增检测部分主要取决于前步骤核酸提取的纯度，以及扩增仪器的性能，因此核酸检测产品本身的差异性关键在于“核酸提取”这一步。
核酸提取技术亦可分为2部分，<样本裂解>与<核酸纯化>，目前市面上常见的样本裂解技术有<物理加热裂解>、<蛋白酶K裂解>、<一步法核酸提取>，核酸纯化技术有<梯度离心法>、<硅胶模柱法>、<磁珠法>。因此对于核酸提取技术的不同，样本裂解及核酸纯化环节不尽相同，操作繁琐程度不同，提取效率、核酸的纯度亦会不同。而复杂的操作更易导致气溶胶污染，带来交叉感染的风险。因此，选择合适的提取技术，对当前疫情防控至关重要。




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03简便、快速、安全的核酸提取方案：
一步法RNA技术
“一步法RNA技术”不仅能提供完整的核酸提取+扩增方案，还提高了检测效率。提取技术分为“样本裂解”、“核酸纯化”2个步骤：

①　第一步，样本裂解。普通的样本裂解技术<物理加热裂解>、<蛋白酶K裂解>均需加热，导致气溶胶污染等一系列问题。“一步法RNA技术”使用<一步法核酸提取>技术，无须加热煮沸，简便，快速，经济。

②　第二步，核酸纯化。近年来体外诊断行业技术突飞猛进，从<梯度离心法>、<硅胶模柱法>，到<磁珠法>的进步，一步步减少了核酸丢失，简化步骤，并提高了核酸纯化的纯度及效率。“一步法RNA技术”由于第一步样本裂解的技术优势，可以完全省去此步骤，做到“免纯化”，搭载此提取技术的新型冠状病毒核酸检测试剂灵敏度可达200copies/ml；可用于快速筛查分流，对疑似病例实现快速检测快速报告，区分是否感染新型冠状病毒。请看操作视频：




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精准、高效、安全的核酸提取方案：
常温磁珠法技术
对于检验工作人员来说，可能磁珠法更加深入人心。“常温磁珠法技术”同样是在不加热的前提下，相较于其他核酸提取技术更加简化了操作步骤，仅需一次洗涤，可降低气溶胶污染的风险，降低交叉感染的几率；未使用乙醇，无乙醇残留抑制下游PCR反应的风险；且纯度更高，灵敏度和准确度更高，可让搭载此提取技术的新型冠状病毒核酸检测试剂灵敏度更高。可用于精准指导抗病毒治疗，评估抗病毒治疗效果，判断治疗终点，为临床提供可靠的辅助诊断依据。




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系统性核酸检测解决方案
病毒核酸检测是一种从基因水平进行检测的方法，作为本次新型冠状病毒疫情抗战的“主力军”，相较于其他方法学，具有更高的特异性和灵敏性，成本低，便于实施。
此次搭载圣湘特色提取方法的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，提供了一套完整系统的抗疫核酸检测解决方案：
a. 可满足快速筛查分流、精准诊断、辅助诊疗、评估疗效等全面需求；
b. 相比于其他需要核酸纯化步骤的检测产品，将更具优势——不需煮沸，不需转管，操作简便，最大程度减少交叉感染的风险，保证医护人员的安全；
c. 并在保证提取效果、检测准确性的前提上进一步提升检测效率。

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