如虎添翼！IF/FISH双染究竟有多强？

奋斗的小鸟

免疫组化(IHC)是在形态学进行蛋白质表达定位和定量的检测方法，相对应的，原位杂交(ISH)是在形态学进行核酸表达定位和定量的检测方法。蛋白质和核酸的实验分析，为科学家揭示了蛋白质表达及调控的原理和过程。但是，受到研究靶点太过新颖或者种属来源比较稀少等因素的制约，科学家往往找不到合适的抗体进行检测研究。此时，需要采用IHC和ISH联合的技术，进行双标检测--通过IHC确定细胞的类型(特异性marker蛋白质)，通过ISH确定核酸的表达情况，同时揭示蛋白质和核酸的表达情况。

小优将为大家送上一篇Nature Protocol技术干货，为大家解析RNA ISH/FISH以及IF/FISH双标检测的实验流程。


Sandra G Zimmerman, et al. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA Double Labeling (IF/FISH) in Drosophila Ovaries. Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2158-79.

小优要为您梳理一下RNA ISH/FISH以及IF/FISH双标检测的完整实验过程。

全力加载文献实验流程



图1. ISH，FISH以及(IF/FISH)双标的步骤流程图

IF/FISH双标实验流程：Box 2&3→实验步骤1-2→Box 1→实验步骤13-20
ISH和FISH实验流程：Box 2&3→实验步骤1-20

Box.1  IF/FISH●5d



图2. IF和FISH检测结果图

组织制备及一抗孵育●5小时+过夜
（1）解剖卵巢后(步骤2)，弃去EBR试剂(余量略微覆盖卵巢，使其不会变干)，采用500 µl(或足够量)的PBT稀释的4%(vol/vol)多聚甲醛(含1% DMSO)，室温固定20分钟。该试剂请现配现用。
（2）弃去固定试剂，采用1ml的PBT中冲洗卵巢3次，每次5分钟。
（3）采用1ml含1%(vol/vol) Triton X-100的PBT渗透样品1小时，采用P-1000移液器轻轻吹打，将卵巢分离。
（4）采用1ml的PBT中冲洗卵巢3次，每次5分钟。
（5）采用1ml含0.1%(vol/vol) DEPC的PBT冲洗卵巢2次，每次15分钟。
（6）采用1ml的PBT中冲洗卵巢3次，每次5分钟。
（7）采用1ml的PBT:WBR试剂封闭样品1小时。
（8）在4°C条件下，采用PBT:WBR试剂稀释的一抗孵育过夜。至少使用250 µl一抗稀释液，使得保抗体稀释液完全覆盖卵巢。
二抗孵育及组织脱水●5–6小时
（9）弃去一抗稀释液(保存如需)。
（10）采用1ml的PBT:WBR试剂洗涤样品4次，每次10分钟。
（11）弃去清洗液，在1ml的PBT:WBR稀释的二抗(1:500)中孵育2–3小时，注意避光进行反应。(可选)向抗体稀释液中添加RNase抑制剂(0.2 U µ-1)和DTT(1mM)。
（12）弃去二抗稀释液，采用1ml的PBT:WBR(避光)将样品洗涤4次，每次10分钟。
（13）弃去PBT:WBR，采用1ml的PBT洗涤样品1次，10分钟。
（14）弃去PBT，在室温条件下，采用500μl的PBT稀释的4%(vol/vol)多聚甲醛(无DMSO)固定样品30分钟。
（15）弃去固定液，采用1ml的PBT洗涤样品3次，每次5分钟。
（16）在室温条件下，采用1ml的PBT稀释的梯度溶度乙醇将卵巢进行脱水：在25%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；在50%(vol/vol)乙醇中5分钟；在75%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；在100%(vol/vol)乙醇中洗涤3次，每次5分钟。
FISH的透膜和复水●4.5小时
（17）在室温条件下，采用1ml的二甲苯:乙醇溶液(9:1)中孵育1小时，用箔纸覆盖避免光照。
（18）弃去二甲苯，采用1ml的100%乙醇冲洗样品，使组织沉降，后弃去乙醇，采用1ml的100%乙醇中冲洗样品5分钟。
（19）在室温条件下，采用1ml的PBT稀释的梯度溶度乙醇将卵巢进行复水：在75%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；在50%(vol/vol)乙醇中5分钟；在25%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；采用PBT洗涤3次，每次5分钟。
（20）每管组织预备3 ml RIPA缓冲液(现配现用)。
（21）在室温条件下，采用1ml的RIPA缓冲液洗涤3次，每次30分钟，对组织进行透膜(注意需要避光)。
（22）采用1ml的PBT洗涤样品2次，每次5分钟。在室温条件下，采用500μl的PBT稀释的4%(wt/vol)多聚甲醛固定30分钟。
（23）采用1ml的PBT洗涤组织3次，每次5分钟，然后进行步骤13，进行FISH(荧光抗体对光敏感，后续步骤中组织需避免光照)。

Box.2  DIG标记RNA探针合成●2天

执行此方案涉及的溶液制备过程，请采用DEPC处理水。

模板DNA的制备●4–6小时
（1）采用适当的限制酶，线性化至少3 µg含有目的cDNA或序列的质粒DNA(反应体系为30 µl)。使用剪切酶获得正义探针(剪切目的序列3')或反义探针(剪切目的序列5')。将样品在37°C(或酶的推荐温度)条件下孵育2小时，后采用凝胶电泳验证切割和未切割DNA样品(1 µl)是否完全线性化。如果线性化不完全，请继续酶切并通过凝胶电泳进行验证。
（2）采用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化线性化质粒。检测DNA浓度(13 µl至少含1 µg)。由3 µg质粒DNA的消化物，纯化并洗脱以获得30 µl，预计浓度约为100-150 ng/µl。如果浓度太低，采用真空干燥操作浓缩样品。
DIG标记的RNA探针的合成●4.5小时
（3）对于每个反义和正义探针，请根据cDNA的方向和需要转录的链选择要使用的RNA聚合酶(T7，T3或SP6)。对于每个探针，使用DIG RNA标记试剂盒进行DIG标记：在冰上采用无菌无RNase的1.5 ml离心管配制下表所示的20 µl反应体系；轻拂试管轻轻混合，短暂离心，然后在37°C条件下孵育2小时：



（4）向离心管中加入2 µl不含RNase的DNase1(标记试剂盒成分)，在37°C条件下孵育样品15分钟，以降解模板DNA。
（5）加入2 µl的0.2 M EDTA终止反应，充分混合。取1µl的反应液，采用甲醛变性凝胶电泳检测探针的质量以及大小(Box 2. 7-14)。
（6）向每个反应体系添加3 µl 3 M乙酸钠、10 µg载体tRNA以及90 µl乙醇，用以沉淀探针。将探针体系混合并冷冻至少2 h或在-80°C过夜：
3 µl 3 M乙酸钠
10 µg载体tRNA
90 µl乙醇
变性琼脂糖/ MOPS /甲醛凝胶检测RNA探针质量●2小时(探针沉淀时)
这一部分在本文中省略，大家可以通过后台留言的方式向小优索取。

Box.3 Dot Blot评估RNA探针●4h

这一部分在本文中省略，大家可以通过留言的方式向小优索取。
实验步骤
执行此方案涉及的溶液制备过程，请保持无RNase条件。



图3.ISH和FISH检测结果图

制备果蝇培养基●1-2天
（1）在装有湿酵母糊的瓶中放入适量雌性果蝇和雄性果蝇，在25°C下培养24-48小时，以获取1-2日龄的成年雌性果蝇。

解剖获取果蝇卵巢(第1天)●1小时/样品
（2）在EBR中，每个样本解剖25-50个卵巢对。在CO2垫上麻醉果蝇。使用镊子挑选果蝇并将其浸入预冷的1×EBR中。用一对镊子轻轻抓住胸下部和上腹部。用另一对镊子，撕开腹部的后尖端，拉出卵巢，将其与肠管和马氏小管分开，将卵巢对转移到装有新鲜EBR的培养皿中。轻轻地将镊子穿过卵巢的生殖器末端，使卵巢破裂。此操作便于后续进行固定和透膜，并避免染色出现梯度。将卵巢放入含有EBR的1.5ml离心管并保存在冰上，直至准备进行固定步骤为止。

ISH和FISH的样本制备●3小时
（3）弃去EBR试剂(余量略微覆盖卵巢，使其不会变干)，采用500 µl(或足够量)的PBS稀释的4%(vol/vol)多聚甲醛(含1%DMSO)，室温固定1小时。该试剂请现配现用。
（4）在室温条件下，采用1×PBS洗涤样品3次，每次5分钟。
（5）在室温条件下，采用1ml的1×PBS稀释的梯度溶度乙醇将卵巢进行脱水：在25%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；在50%(vol/vol)乙醇中5分钟；在75%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；在100%(vol/vol)乙醇中洗涤3次，每次5分钟。

复水，透膜，RNase失活及探针杂交(第2天)●5-7小时+过夜
（6）在室温条件下，采用1ml的1×PBS稀释的梯度溶度乙醇将卵巢进行复水：在75%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；在50%(vol/vol)乙醇中5分钟；在25%(vol/vol)乙醇中浸泡5分钟；采用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
（7）在室温条件下，采用1ml蛋白酶K对卵巢进行透膜1小时。
（8）在室温条件下，采用1ml的1×PBS稀释的0.2%(wt/vol)甘氨酸溶液洗涤卵巢2次，每次5分钟，以使蛋白酶K失活。
（9）在室温条件下，采用1ml的1×PBS洗涤卵巢5分钟，后采用1ml的1×PBT洗涤2次，每次5分钟。
（10）在室温条件下，采用500μl的1×PBT稀释的4%(vol/vol)多聚甲醛(当天配制)固定样品30分钟。
（11）弃去固定液。采用1ml的PBT洗涤卵巢2次，每次5分钟，后在室温条件下采用1ml的PBT稀释的0.1%(vol/vol)DEPC中孵育2次，每次15分钟。
（12）在室温条件下，采用1ml的1×PBT洗涤样品3次，每次5分钟。
（13）在室温条件下，采用1ml的PBT:HYB溶液(vol/vol=1:1)孵育5分钟，后采用1ml的100% HYB孵育样品5分钟。
（14）在60°C条件下，采用1ml的HYB溶液预杂交1小时。
（15）稀释DIG标记的RNA探针，采用1:500或1:1000的比例进行稀释。
（16）在68°C条件下，将稀释的RNA探针变性10分钟。后将探针在冰上冷却5分钟以防止形成二级结构，然后进行短暂地旋转冷凝以收集标记探针。
（17）尽可能去除步骤14样品中的HYB溶液，后添加探针并在60°C孵育过夜。

杂交后的洗涤和封闭(第3天)●2小时
（18）将洗涤液(后置配方)预热至65°C。将探针分离，如果需要，将其保存在-20°C以便再次使用。按以下步骤采用预热的洗涤液中于65°C洗涤样品：在1ml的100% HYB中洗涤20分钟，后在PBT/HYB(vol/vol=1:1)混合液中洗涤20分钟，后在1×PBT中洗涤5次，每次5分钟。
（19）在室温条件下采用1ml的PBT:WBR液封闭样品1小时。

DIG抗体孵育与信号检测

（20）mRNA转录物的检测，按照步骤A采用ISH检测，按照步骤B采用FISH和IF/FISH检测。

(A)DIG抗体孵育和比色信号检测●过夜+至少2小时
(i)弃去封闭溶液，向PBT:WBR中加入1:2000稀释的洋地黄毒苷碱性磷酸酶抗体(每次使用前，将抗体在原装瓶中采用8000g于4°C离心5分钟，然后小心取表面液体)。在4°C条件下将样品孵育过夜。
(ii)用1×PBT洗涤样品3次，每次5分钟。
(iii)用1×PBT洗涤样品3次，每次20分钟。
(iv)将样品转移至24孔板或解剖皿中，采用新鲜配制的缓冲液3中洗涤2次，每次5分钟。
(v)将20 µl的NBT/BCIP储备溶液加入1ml的缓冲液3以获得新鲜制备的NBT/BCIP溶液。采用200 µl的NBT/BCIP溶液孵育卵巢样品。
(vi)弃去NBT/BCIP溶液，加入400 µl体积分数为50%的甘油(1×PBS配制)以终止反应。5分钟后，加入400 µl体积分数为80%的甘油(1×PBS配制)，后平衡1小时至过夜。
(vii)将一小块卵巢转移到干净的盖玻片上(在22-×22-mm盖玻片上为15-20 µl，在22-×50-mm盖玻片上为50 µl)。解剖卵巢以分开卵室，后加盖干净的盖玻片。为了获得最佳图像，请对较少数量的卵室进行封片。采用透明指甲油密封边缘。
(viii)立刻使用DIC显微镜观测样品，或将载玻片冷冻在-20°C条件以限制染色的扩散。未封片处理的甘油悬浮卵巢样本可以无限期保存在-20°C下。

(B) DIG抗体孵育及FISH和IF/FISH的TSA反应●过夜+ 6小时
(i)弃去封闭溶液，向PBT:WBR中加入1:500稀释的生物素偶联的洋地黄毒苷抗体(如果要进行多次酪酰胺扩增，则添加其他抗体)。在4°C条件下将样品孵育过夜。
(ii)采用1ml的PBT:WBR洗涤6次，每次10分钟。
(iii)在室温、持续摇动混匀的条件下，采用PBT:WBR稀释的1:100的链霉亲和素-HRP(来自TSA试剂盒)孵育样品，1小时。至少使用250 µl，以确保组织被溶液完全覆盖。
(iv)(可选)进行核复染色，采用PBT:WBR冲洗卵巢一次，然后采用PBT:WBR稀释的终浓度为1 µg/ml的DAPI孵育10分钟。为了节省时间，可以在上一步的最后10分钟内将稀释的DAPI直接添加到链霉亲和素-HRP溶液中。
(v)采用1ml的PBT:WBR洗涤6次，每次10分钟。
(vi)采用1×PBT洗涤5分钟。
(vii)采用1×PBS洗涤2次，每次5分钟。
(viii)在洗涤的同时，通过向200 µl扩增缓冲液中加入1 µl过氧化氢，获得过氧化氢储备液(由TSA试剂盒提供)。
(ix)采用扩增缓冲液中以1：100稀释储备液。
(x)将酪酰胺(TSA试剂盒提供)添加到稀释的储备液中，以1:50至1:100的比例稀释酪酰胺，每个样品准备250 µl的酪酰胺溶液。
(xi)弃去样品中最后的PBS洗涤液(步骤20B(vii))，加入250μl的酪酰胺溶液，并在避光、室温的条件下将样品混合孵育15分钟至2小时。
(xii)在避光的条件下，采用1ml的PBS洗涤样品6次，每次10分钟。
(xiii)将样品重悬于100-200 µl的适当的抗漂白封闭液(如DABCO)中。在避光、4°C条件下让平衡样品1-3 h或过夜。
(xiv)将一小块卵巢转移到干净的盖玻片上(例如，在22-×22-mm盖玻片上为15-20 µl，在22-×50-mm盖玻片上为50-80 µl)。解剖卵巢以分开卵室，后加盖干净的盖玻片。为了获得最佳图像，请对较少数量的卵室进行封片。采用透明指甲油密封边缘。
(xv)采用荧光或共聚焦显微镜分析卵巢样品。

全力加载实验试剂

本文中，作者详细罗列了每个实验步骤中所用到的实验试剂/耗材/仪器，但因篇幅有限，小优在此只罗列了部分主要试剂。若需要详细清单，大家可以通过后台留言的方式向小优索取~



RNA FISH及蛋白质-RNA双染(IF/FISH)相关文献

1. Wang F, et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 2012. 14(1): 22–9.
2. Shi Y, et al. Targeting LIF-mediated paracrine interaction for pancreatic cancer therapy and monitoring. Nature. 2019. 569(7754): 131–135.
3. Givel AM, et al. miR200-regulated CXCL12β promotes fibroblast heterogeneity and immunosuppression in ovarian cancers. Nat Commun. 2018. 9(1): 1056.
4. Xing L, et al. Wnt/β-catenin signaling regulates ependymal cell development and adult homeostasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018. 115(26): E5954–E5962.
5. Germán B, et al. Disrupting the IL-36 and IL-23/IL-17 loop underlies the efficacy of calcipotriol and corticosteroid therapy for psoriasis. JCI Insight. 2019. 4(2).
6. Baker AM, et al. Distribution of the c-MYC gene product in colorectal neoplasia. Histopathology. 2016. 69 (2): 222–229.
7. Bu DX, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen(BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018. 9(40): 25764–25780.
8. Pratt DD, et al. Programmed Death Ligand 1 Is a Negative Prognostic Marker in Recurrent Isocitrate Dehydrogenase-Wildtype Glioblastoma. Neurosurgery. 2019. 85(2): 280–289.

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/162948626