什么是单分子荧光原位杂交（smFiSh）?

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他和FISH有什么区别呢？为什么他可以检测单个的RNA呢。

原文地址：https://www.zhihu.com/question/560004949

大力水手

单分子荧光原位杂交（smFISH）是分子生物学中用于检测RNA分子在细胞中定位和表达的技术。
它基于原位杂交技术，使用荧光标记的探针与目标RNA结合，形成荧光信号，通过显微镜观察可以观察到RNA的位置和数量。与传统的原位杂交技术不同的是，smFiSh可以检测单个RNA分子，因此可以更准确地定量RNA的表达水平和定位。


此外，smFISH还可以对RNA进行多重染色，即同时检测多个RNA分子的位置和表达水平。
smFISH技术在生物医学研究中有广泛应用，可以用于研究细胞分化、发育、疾病等方面，尤其在神经科学领域得到了广泛的应用。
<hr/>单分子荧光原位杂交（smFISH) 和FISH有什么具体的区别？

首先来简单介绍一下荧光原位杂交技术（FISH）的原理：
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂合，可用于染色体上基因的定位，是临床病理检测中广泛运用的一种分子细胞遗传学诊断技术。


利用杂交的原理，用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核特定靶DNA序列杂交，通过荧光显微镜观测荧光信号位置、大小及数量来判断待测序列的缺失、扩增及易位等情况。



FISH技术原理

单分子荧光原位杂交（smFISH）和FISH（荧光原位杂交）的区别？

大致可以分为以下5点：
1. 检测对象：FISH可以检测到多个RNA分子，而smFiSh可以检测到单个RNA分子。
2. 灵敏度：smFiSh比FISH更加灵敏，可以检测到低表达水平的RNA分子。  
3. 定量能力：smFiSh可以定量RNA的表达水平，而FISH只能定性地检测RNA的存在与否。
4. 染色方式：smFiSh使用多个探针对RNA进行多重染色，而FISH通常只使用一个探针对RNA进行染色。  
5. 成本：smFiSh比FISH成本更高，需要使用更多的试剂和设备。
总的来说，smFiSh比FISH更加精准和灵敏，但成本更高，适用于对RNA表达量和定位要求较高的研究。而FISH则适用于对RNA表达量和定位要求不高的研究。
<hr/>为什么单分子荧光原位杂交（smFISH）可以检测单个的RNA？

大致原因可以归类为以下4个部分
1. 探针设计：smFiSh使用经过精心设计的多个荧光标记的探针，每个探针只能与RNA的某个特定区域结合，因此每个RNA分子只会与一个探针结合。  
2. 荧光信号：由于每个RNA分子只与一个探针结合，因此每个RNA分子只会产生一个荧光信号，这使得smFiSh可以检测单个RNA分子。
3. 荧光强度：由于每个RNA分子只与一个探针结合，因此每个RNA分子产生的荧光信号比FISH强度更强，并且可以更加准确地定量RNA的表达水平。  
4. 显微镜分辨率：smFiSh使用高分辨率的显微镜观察荧光信号，可以更加精确地检测单个RNA分子的位置和数量。  
总的来说，smFiSh能够检测单个RNA分子是因为它使用了多个荧光标记的探针，每个探针只能与RNA的某个特定区域结合，并且使用高分辨率的显微镜观察荧光信号。

长长的路

传统FISH探针比较长，实验大概要2-3天；
新技术，单分子RNA荧光原位杂交技术，不仅缩短了实验的时间(1-1.5天)，灵敏度、特异性、兼容度等还更高。该技术英文缩写”asmFISH“，英文原文是“ amplification-based single molecule fluorescence in situ hybridization”
通过特异性探针的结合到靶标RNA分子后，进行滚环扩增（数百至上千倍以上的增强信号，滚环扩增技术，RCA, rolling circle amplification）就可以实现单个RNA的检测。
简单原理图如下：



图片来源文章：Imaging of individual transcripts by amplification-based single-molecule fluorescence in situ hybridization

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