动物实验技术 | 教你怎么做大鼠肝缺血再灌注模型

生物科研实验室

实验对象 ·选用纯种SD雄性大鼠，体重范围180-250g，以标准饲料饲养，自由饮水，环境控制于室温20-26℃，每日光照12-14小时，术后单独笼养。
分组情况：设立正常对照组、模型组、阳性药物对照组及受试药物组（含三个不同剂量亚组），每组均包含15只大鼠。· 手术流程 ·①大鼠仰卧固定于手术台，背部垫高，腹部剃毛消毒，佩戴无菌手套，铺展自制无菌开孔纱布。自剑突至耻骨上1cm处，沿腹中线逐层切开皮肤、肌肉及腹膜，进入腹腔。
②使用血管钳控制出血，同时将上腹壁组织向外上牵引，充分显露隔下及腹腔内部。以无菌温热0.9%氯化钠纱布包裹肠管并移至右下腹。轻柔分离肝周韧带，包括镰状韧带及左右三角韧带，使肝左、中、右叶游离。
③将肝脏向左上方牵拉，分离右下叶与后腹膜粘连，于十二指肠球部上缘识别并分离肝蒂（含胆总管、肝动脉、门静脉）。使用无创血管夹夹闭中叶及左叶的门静脉与肝动脉，造成约70%肝脏缺血，避免肠系膜静脉严重淤血。
期间将肝脏、胃、肠还纳入腹，以温热生理盐水纱布覆盖切口。30秒后，阻断叶颜色明显变白，确认阻断成功，随即用止血钳夹闭皮肤切口，临时闭合腹腔，并将大鼠置于37℃恒温加热垫上保温。
④60分钟后解除血管夹，进入再灌注阶段。观察肝脏、胃肠逐渐恢复血色，由暗红转为鲜红，表明再灌注成功；若复流受阻，则终止实验。
术后于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h时间点，麻醉大鼠并摘眼球采血。血液室温静置2小时后，于4℃条件下3000rpm离心10分钟提取血清，存储于-80℃冰箱。
采用全自动生化分析仪测定血清ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）水平。同时，统一切取肝左叶组织块（1.5cm×1cm×0.2cm）作为病理或分子生物学研究样本。· 模型评估 ·1、于术后0h、3h、6h、12h、24h及72h时间点，分别测定大鼠血清中ALT（谷丙转氨酶）与AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的浓度。
2、统一切取肝左叶组织块（1.5cm×1cm×0.2cm），置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时后进行脱水、包埋处理，随后制作石蜡切片，并进行HE染色与TUNEL染色，依据以下标准对肝细胞坏死程度进行评分：
0分：肝细胞无损伤；1分：轻度损伤，表现为细胞质空泡化，部分细胞核固缩；2分：中度损伤，血窦扩张，细胞质广泛空泡化，细胞界限模糊；3分：中度至重度损伤，出现凝固性坏死，血窦显著扩张，红细胞外渗至肝窦，嗜酸性粒细胞增多，中性粒细胞贴壁；4分：严重坏死，肝脏结构丧失，肝索瓦解，伴有出血及中性粒细胞广泛浸润。
3、肝脏损伤后，血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6及ICAM-1等细胞因子表达量显著上升，可通过ELISA方法进行定量检测。
·注意事项·(1) 术前大鼠需禁食12小时，但可自由饮水，以减少胃肠道内容物对手术的干扰。(2) 腹部切口应尽可能小，操作时利用镊子轻轻拎起腹壁，以减少组织损伤；遇出血点应立即以止血钳精准夹闭。(3) 分离肝蒂时需格外谨慎，采用棉签进行钝性分离，避免损伤导至出血及休克风险。(4) 尽量减少对周围组织的干扰，特别是避免损伤肝蒂下方的下腔静脉，以防大出血引发休克乃至死亡。(5) 夹闭肝蒂时需准确迅速，一次性完成，以免因反复操作导至缺血预处理，影响模型构建效果。(6) 夹闭肝蒂后，需将肝脏及胃肠道轻柔还纳至原位，并保持腹腔内水分，用温热的生理盐水纱布覆盖手术区域。(7) 术中需持续监测并维持大鼠体温，将其置于恒温毯上保暖，防止因寒战引起的应激反应导至生命体征波动。