利用CRISPR进行全基因组筛选

青草

哪些基因对于您想要研究的表型是重要的?许多研究人员研究遗传原因并不完全清楚的疾病时，如果确定哪些基因对表型是重要的，那么就可以进行大量的其他实验来研究单个基因或整个通路在特定疾病过程中的作用。虽然CRISPR肯定不是进行所谓"阳性遗传筛选实验"的首选，但它肯定是最强大的。下面将讨论如何利用CRISPR文库进行全基因组筛选。
是什么让CRISPR如此特别?

与以前的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9的一个主要优点是它的简单性和通用性。CRISPR/Cas9由非特异性核酸内切酶(Cas9)和单链向导RNA(gRNA)两部分组成。gRNA中~ 20个核苷酸的靶向序列是由研究人员设计的，它可以很容易地被设计为将Cas9定位到几乎任何基因组位点，前提是该靶点与基因组的其他部分相比是独特的，并且位于原间隔区邻近基序(PAM)序列的5 '端。野生型Cas9和gRNA的共同递送会在靶DNA中产生双链断裂，当通过易错的非同源末端连接(NHEJ)进行修复时，通常会导致靶基因内发生功能性缺失的突变。CRISPR还可用于激活或抑制靶基因，而不对基因组进行永久性修饰。
哪些基于CRISPR的试剂可用于全基因组筛选?

全基因组筛选实验的目标是产生和筛选发生突变的细胞群体，以鉴定与特定表型相关的基因。由于CRISPR的潜在靶序列范围广泛，且易于获得含gRNA的质粒，因此可以很容易地用于全基因组筛选。CRISPR全基因组筛选实验通常使用慢病毒将混合的gRNA递送到Cas9表达的细胞中。混合慢病毒CRISPR文库(简称为" CRISPR文库")由一组异质性的含gRNA的慢病毒转移载体组成，每个转移载体靶向基因组中的特定基因。使用公开的gRNA设计软件对单个gRNA进行设计并合成。然后将混合的gRNA克隆到慢病毒转移载体中，构建CRISPR文库。通过将gRNA文库与上述Cas9的衍生物结合，研究人员已经创建了CRISPR文库来敲除、激活或抑制靶基因。
选择合适的CRISPR文库

在选择CRISPR文库进行实验时，有几个因素需要考虑。
1 .你的细胞来源于什么种属。
2 .你想做什么基因修饰?
3 .你的最终目的是针对基因组中的每一个基因，还是某一类特定的基因?
CRISPR的筛选步骤是什么?

利用CRISPR文库进行阳性遗传筛选是一个多步骤的过程(见图1)。在大多数情况下，CRISPR文库提供的浓度太低，不适合实验使用。因此，第一步是将文库扩增至足以产生慢病毒的浓度。确保使用二代测序来检测扩增的质量。


然后用含有CRISPR文库的慢病毒转染细胞，以产生突变细胞的异质群体，每个细胞或一组细胞含有不同基因的突变。文库可以采用1-质粒系统，其中Cas9包含在含有gRNA的质粒上，也可以采用2-质粒系统，其中Cas9必须单独递送。使用药物筛选或基于荧光的细胞分选来富集突变细胞，并针对特定的表型进行筛选。例如，突变细胞可以用于药物筛选，以鉴定导致耐药性的基因。用药物处理突变细胞，与未处理的对照组相比，分析耐药细胞群中gRNA的分布情况。在这种情况下，"富集"的gRNA与突变时赋予耐药性的基因相对应。这类实验的发现可以揭示细胞对药物产生耐药性的机制，并可以为导致细胞生长失控的疾病(如癌症)确定未来的治疗靶点。
关于成功筛选的一些思考和提示

二代测序- -CRISPR文库包含数以千计的gRNA质粒，每个质粒上只有一个唯一的识别序列。因此，在扩增后和筛选后对CRISPR文库进行测序需要进行二代测序。
代表性- -大多数文库每个靶基因含有3 - 6个gRNA，保持每个gRNA在群体内的分布是关键。由于特定gRNA的富集或缺失而失去代表性，可能会导致结果分布不均匀的情况。
选择细胞类型- -理论上，任何细胞类型都可以用于CRISPR筛选。然而，在突变群体中保持足够的代表性需要大量的细胞作为起始材料。因此，丰度较低的细胞类型并不特别适合全基因组筛选。
避免假阳性和假阴性- -与任何实验一样，使用适当的对照、多次重复和几种细胞类型可以加强结果的可信度。靶向同一基因的多个gRNA的富集或缺失可以有力地证明特定基因对特定表型的重要性。每一个来自筛选的克隆都应该单独验证，以确保预期的基因编辑产生了筛选得到的目的表型。
通过适当的实验设计和验证实践，CRISPR文库可以帮助了解很多你感兴趣的表型。
参考文献
McDade JR, Waxmonsky NC, Swanson LE, Fan M (2016) Practical Considerations for Using Pooled Lentiviral CRISPR Libraries. Current Protocols in Molecular Biology 115: . https://doi.org/10.1002/cpmb.8
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