原位杂交实验要求及步骤

乔帮主

原位杂交组织（或细胞）化学 （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH） 简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求

1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：
（1）保持细胞结构；
（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；
（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：
（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
（3） 蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4. 杂交缓冲液孵育：
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。

5. 防止污染：
由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。

6. 双链DNA探针和靶DNA的变性：
杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交（包括检测RNA时），双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。

二、试剂准备

1. 0.1 M PBS (pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6 g、NaH2PO4•2 H2O 5.6 g、NaCl 9 g，加ddH2O至2000 ml，高压灭菌。

2. 0.2 M PB ((pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6 g、NaH2PO4•2 H2O 5.6 g 加ddH2O至1000 ml，高压灭菌。

3. 0.1 M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1 M PBS，定容至100 ml，高压灭菌。

4. 4%多聚甲醛：多聚甲醛40 g加ddH2O 400 ml，加热至70℃左右，用1 M NaOH调pH至7.0，用ddH2O定容至500 ml，再加0.2 M PBS 500 ml，总体积为1000 ml。

5. 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4 g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4 g、聚蔗糖0.4 g，加dd H2O至10 ml，无菌抽滤、分装， -20℃保存备用。

6. 预杂交液：去离子甲酰胺10 ml、50%硫酸葡聚糖4 ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2 ml、1 M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2 ml、5 M NaCl 1.2 ml、0.5 M EDTA(pH 8.0) 0.04 ml、0.1 M 二硫苏糖醇 2 ml、ddH2O 2.21 ml，总体积为10 ml。无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。临用前加入50 mg/ml 变性鲑鱼精DNA 75 μl/ml。

7. 20×SSC: NaCl 175.3 g、柠檬酸三钠88.2 g，加水至800 ml，用2 N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000 ml。

8. 抗体稀释液：Triton X-100 80 μl、BSA 0.2 g，以0.05 M PBS定容至20 ml。

9. TSM1：1 M Tris-HCl(pH 8.0)10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl21ml，加ddH2O 100 ml。

TSM2（新鲜配制）：1 M Tris-HCl(pH 9.5)10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl21 ml，加ddH2O至100 ml。

显色液（临用前现配）：5 ml TSM2 加显色液原液（NBT/BCIP）150 μl，并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24 μg/ml，避光。

三、操作步骤

（一）取材、冰冻切片：

将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（见图2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。

（二）探针制备与检测（定量）：

1. 随机引物制备cDNA核酸探针以DIG DNA 标记检测试剂盒为例：

（1）探针制备：

①模板DNA(0.5-3 μg) 15 μl，100℃变性10 min，冰浴5 min。

②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl， dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反应总体积为20 μl。37℃孵育过夜。

③在上述20 μl 的标记产物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（无水乙醇预冷，轻轻混匀，-20℃放置 2 hr。4℃离心12 000 g×15 min，弃上清。70%乙醇（预冷） 50 μl 洗涤，7 500 g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存备用。

（2）探针敏感性检测：

①样品稀释：取dig-标记探针1 μl 用ddH2O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀释。

②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡 1 min，6×SSC中浸泡10 min，置点样器上，负压抽吸5 min。

③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10 min。

④取下尼龙膜，置紫外灯下10 cm 处照射5 min，晾干。

⑤将膜置于适量预杂交液（5-10 ml）中，37℃预杂交10 min。

⑥加入Anti-dig 抗体（1：5000），37℃杂交30 min。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。

⑧显色：15 ml TSM2中加300 μl 显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30 min。

2. PCR法制备cDNA核酸探针：

（1） 探针制备：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例：

在0.5 ml 离心管中，依次加入：

PCR引物 1（10 pM） 2 μl；

PCR引物 1（10 pM） 2 μl；

质粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；
PCR DIG mix 2 μl (含dNTP和DIG-11-dUTP)；

dNTPmix 2 μl；

10×PCR buffer 5 μl；

Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；

加入适量ddH2O，使总体积达50 μl。

① 将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7 min。

② 在上述PCR产物中加入4 M LiCl 12.5 μl、预冷无水乙醇375 μl，轻轻混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，弃上清。70%乙醇(预冷) 120 μl 洗涤沉淀，离心7500g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存备用。

（2）探针检测：

行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。

（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：

0.1 M PBS (pH 7.2) 浸 5-10 min。

0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。

0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。

0.1 M PBS 洗 5 min×3次，加蛋白酶K(1 μg/ml)，37℃孵育30 min。

4%多聚甲醛浸5 min。

0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。

预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。

（1）杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20 μl 杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过夜。

（2）洗片：

4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；

0.2×SSC 37℃洗10 min；0.2×SSC与0.1 M PBS各半洗10 min；

0.05 M PBS 洗 5 min×2次。

3% BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。

滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。

0.05M PBS洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次；新鲜配制TSM2 10 min×2次。

显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。

将玻片置于TE中10-30 min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。

显微镜下观察结果。

四、注意事项

1. 作为DNA-RNA的杂交，需防RNase的污染。

2. cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是：将探针置100℃加热5 min，冰浴骤冷。
注：图文来源于网络
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