手把手教学——原位杂交实验流程

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原 位 杂 交 组 织 ( 或 细 胞 ) 化 学 (In situ Hybridization Histochemistry ， ISHH) 简 称 原 位 杂 交 (In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的 DNA 或 RNA 为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。


FISH原理示意图
一、合成RNA探针
1、设计探针引物
RNA探针长度500bp最为合适。一轮引物不添加启动子序列，二轮引物在正向引物的5端加上T7启动子序列，在反向引物的5端加上SP6启动子序列。
2、探针合成
用未添加启动子序列的引物克隆出探针序列的DNA模板，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。胶回收，将其连接到T载体上，转化涂板，进行质粒提取送测。用添加了T7和SP6启动子序列的引物再次给探针序列两端添加上启动子序列。取一轮以质粒为模板扩增PCR产物进行琼脂糖进行PCR扩增，凝胶电泳验证，若条带单一明亮，胶回收PCR产物用于后续体外转录。
3、体外转录
利用PCR扩增出的带有启动子序列探针的DNA模板，分别用相应的RNA聚合酶进行体外转录，得到单链RNA探针。探针包括正义探针和反义探针，用正义探针(T7RNA 聚合酶转录得到)进行的原位杂交实验作为阴性对照组，用反义探针(SP6RNA聚合酶转录得到)进行的原位杂交实验为实验组。体外转录体系如下:

组分名称	体系
探针模板	600ng-1μg
Transcription Buffer (10×)	2μl
RNA Polymerase T7	2μl
NTP labeling mixture (10×)	2μl
RNase Inhibitor (40U/μl)	1μl
RNase-free H2O	补至20μl

混匀后37，孵育2小时。
4、质量检测、中止消化
转录结束后，取1uL 转录产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳条带明亮不弥散则进行下一步。验证后，每管加入2DNase，37消化15min，去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)终止消化反应。
5、沉降洗涤保存
每管用DEPC水补至100uL，加入2倍体积的的无水乙醇和1/10体积的的3M乙酸钠，置于-80℃沉降过夜/-20℃沉降30分钟。将沉降后的体系放入离心机中，4℃，12000rpm离心15分钟，弃除上清。加入100uL70%无水乙醇浸洗，4℃，12000rpm离心15分钟，弃除上清，在超净台风干。将沉淀的RNA探针加入DEPC水溶解，使其浓度为10ng/uL，分装后放入-80℃保存备用。
注意事项：
（1）DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在各步处理中，所有液体试剂都应经 DEPC 处理。
（2）含有 Tris缓冲液的溶液中，不能加入 DEPC。
（3）原位杂交引物用同一个遗传背景的个体克隆全长测序成功，在测序成功的全长序列上设计引物，保证特异性。
二、杂交



图片来源：souhu.com

1、准备工作
①圆形细胞爬片在浓盐酸中浸泡过夜，经超纯水冲洗后，浸泡在无水乙醇中；②将圆形细胞爬片、玻璃培养皿、金属镊子180℃高温烘4h去除RNase；③取出后静置1h冷却，培养皿中加入0.1mg/ml多聚赖氨酸处理。④正、反面各避光浸泡15min；⑤ 用镊子依次夹取玻片，迅速蘸取DEPC水，正面朝上放在锡箔纸折起的褶皱上，37℃放置3h备用。
2、组织包埋与切片
原位杂交实验组织石蜡包埋，将包埋好的蜡块从-20℃取出，刀片、台面、切片机等用RNase抑制剂喷雾喷洒擦净，修整好的蜡块固定于切片机上，切片厚度设置为5μm，将蜡带在43℃ DEPC水中水浴展开，用多聚赖氨酸处理过的圆形玻片捞取蜡带，置于锡箔纸褶皱上37℃烘干过夜。
3、脱蜡与复水
镊子夹取圆形玻片依次于下述玻璃培养皿中：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脱蜡→二甲苯：乙醇（1:1） 6min→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度复水。
4、预杂交
①镊子夹取圆形玻片至24孔板中，每孔加入500μl DEPC水洗涤4min；②加500μl PBST（1×PBS+0.1%Tween-20)洗涤10min，洗2次；③加300μl 2μg/ml蛋白酶K，37℃消化12min；④加500μl 0.1M TEA孵育10min；⑤加500μl PBST 10min，洗涤两次；⑥加500μl 4%的多聚甲醛，避光固定20min；⑦加500μl PBST，10min，洗涤两次；⑧加300μl HB杂交液，60℃预杂交4h。
HB杂交液的配制：

组分名称	体系
去离子甲酰	10ml
20×SSC	5ml
BR	4ml
酵母tRNA(5μg/ml)	400μl
DEPC H2O	400μl
0.1%Tween-20	200μl

HB现用现配，本次实验一次配制3份。
5、探针变性与杂交
将200ng探针加入到30μl HB杂交液中，95℃变性5 min，迅速置于冰上冷却，然后加入到270μl已60℃预热的装有HB杂交液中1.5ml 无酶管中，充分混匀后加入到样品孔中，60℃杂交17h。
6、洗脱探针
洗脱探针所用试剂均需37℃/60℃预热，并在相应环境中洗脱。
洗脱探针条件

洗脱液	温度	洗涤时间	洗涤次数
2×SSC	60℃	20min	2
2×SSC	37℃	10min	2
2×SSC	60℃	20min	1
1×SSC	60℃	20min	1
0.2×SSC+ 0.1%tween20	60℃	20min	1

7、封闭、抗体孵育
①向样品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗涤10min，洗涤两次。②加入300μl Blocking bufferr（1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20）避光封闭1.5h。③按照1：3000比例将Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗体加入到Blocking buffer中，充分混匀后吸取 300μl 加入样品孔，避光孵育 1h。
8、洗涤抗体
向样品孔加入500μl MaNaT洗涤抗体,避光洗涤5min重复2遍，再加入500μl MaNaT洗涤抗体，避光洗涤15min重复4遍。
9、显色及终止反应
吸出 MaNaT，加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗涤两次，每次5min；按1:50的比例将 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中，充分混匀后吸取 400μl 加入样品孔，避光显色10min，镜检观察到蓝紫色信号时，吸出显色液。
10、复染
吸出 PBST，加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min；吸出固定液，加入 500μl PBST 洗涤两次，每次 10 min；吸出 PBST，加入 300μl 1%中性红染液复染。
11、封片
复染后，用镊子夹取玻片，依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脱水；在 100%无水乙醇：二甲苯(1:1)中处理浸泡2min；在二甲苯中浸泡5 min；最终以中性树胶封片。
12、显微观察
使用 1 至 4 倍放大倍数观察组织杂交整体信号表达情况，使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍数观察局部杂交信号，拍照。


A, B:斑马鱼中某基因正义RNA探针信号分布；
C, D: 斑马鱼中某基因反义RNA探针信号分布。

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