做实验 | 用钓鱼的心态，做荧光原位杂交实验

病理医师

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH），缩写为FISH，就是鱼的意思，以此类推，做荧光原位杂交也叫钓鱼。

荧光原位杂交实验

它的实验原理也挺像钓鱼的：它是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。你们看，像不像在茫茫大海里面钓鱼呢？探针像不像鱼钩呢？



钓鱼实验的特点：操作烦琐，步骤简单。
说它操作烦琐，是因为它的操作步骤巨多，每一步又需要相当长的时间，如果自己标探针的话每批标本大约三天时间（买试剂盒只需一天，但价格昂贵），你说是不是很烦琐？说它步骤简单则是因为FISH只要操作过程仔细，严格按照操作步骤操作，很容易做成功，比PCR要简单得多。将繁琐的简单步骤做好也是有门道的。

探针设计，量身定制

探针就是鱼钩。鱼钩不管用，还能钓得上大鱼吗？设计探针要根据实验的需要来进行，也就是说你要检测的目的基因决定你的探针设计。这就像是一个老练的渔夫会根据不同的鱼的种类来选择鱼钩一样。举个例子，如果目的基因大概是1.8KB，可以直接对PCR产物进行地高辛或生物素标记。也可以找技术服务公司帮你设计合成探针，每条探针设计合成大概3500。




组织切片和载玻片的选择

组织切片4～5μm 厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。

注意标本预处理细节

标本的处理也是关系到最后信号强弱的关键，但有些人不注意这些细节，结果造成荧光信号弱，难以分辨。这与预处理不当造成探针难以达到饱和而杂交难以进行有关。

变性要规范

这一步是FISH关键中的关键。变性包括标本变性和探针变性，这两个步骤关系到FISH的成败，千万要严格按照操作规程进行，不但如此，特殊标本还要自己摸条件。试想变性不彻底，DNA的双链都没能完全打开，杂交能顺利进行吗？

操作荧光抗体时要避光

操作荧光抗体的时候千万要避光，否则将前功尽弃啊。举个例子吧。鱼竿，鱼钩，鱼饵都备齐了，也不能保证一定就能钓到大鱼儿。鱼儿上钩了之后，还有一个把鱼拖上岸的最终过程。在FISH，就是使用荧光显微镜观察和记录结果。在正常情况下，目前商业化的探针即使是杂交以后，荧光信号能保存半年之久。有时候，信号也会急剧衰减，几分钟后就不见了。就像鱼儿一开始上钩了，马上又挣脱鱼钩，重返大海了。出现这种情况，就是由于没有严格避光。因此在观察和记录的时候，要尽可能地在暗室里面操作。这和以前洗照片是一个原理哈。




当然，也有偷懒的招术。那就是：抗荧光淬灭剂（antifade），在封片观察的时候加入，可以延缓荧光的淬灭。注意：如果一次没有成功，可以将探针洗掉，再进行杂交。这又像极了钓鱼。第一次鱼儿脱钩了，我们可以换个鱼钩再钓，直到钓到大鱼为止。

FISH其实做出来还是很漂亮很漂亮的。下面就是一张FISH的图，让我们一起感受一下生物学的大美。



大家看，像不像浩瀚的宇宙，璀璨的星空呢？其实，做FISH染出了一张漂亮的片子，也和渔夫钓上了一条大鱼一样。满满的成就感。




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