一文解析流式细胞仪

空白派

流式细胞术( Flow Cytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一项利用流式细胞仪完成的细胞分析新技术。目前已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等基础学科和临床研究的各个领域。(如果读完文章您觉得还有哪些想听的知识点小谱没有讲到，亦或是觉得小谱文章中有哪些观点您不太认同，欢迎您积极留言。)

01“流式细胞仪”的前世今生
在20世纪30年代初，Caspersson和Thorell就开始研究细胞的计数。1936年， Caspersson等将显微分光光度法引入细胞计数中。1949年， Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利。1954年， Beirne和 Hutcheon发明光电粒子计数器。1969年，发明第一台荧光细胞检测仪。1972年，对细胞分选器进行新的改进。1975年， Milstein和 Kohler发明单克隆抗体技术，进一步促进了流式细胞仪的发展。从此，流式细胞仪进入了飞速发展的时代，很多公司相继推出各具特色的流式细胞仪并不断升级完善，使检测性能不断提高。国产流式细胞仪最早研制于20世纪80年代初，但受到当时科技发展和国内生产力的限制，而没有商业化的产品问世。至2010年起开始流式细胞仪的设计、研发和生产，迄今已推出了中国自主研发的具有绝对计数功能的从单激光至三激光甚至可同时分析高达13种荧光颜色的流式细胞分析仪Bricyte E6, Novo Cyte系列等。这些流式细胞仪不仅从性能上能够和国外仪器比肩，也有着自身的特色和优势。例如，具有对插拔滤光片、通道配置更改及升级简便、灵活，能够24管/40管及6/24/96x多孔板上样等功能。进入21世纪，随着光电技术、计算机技术进一步发展，流式细胞仪已开始向模块化、经济型发展。其光学系统、检测器单元和电子系统更加集成化，并可按照使用要求进行灵活的调整和更换。临床型的仪器追求更加自动化的操作，包括自动样本处理及与LS的双向通讯等。（以上内容摘录至网络）

02“流式细胞仪”的基本原理
流式细胞术是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，已经成为近代科学研究中的热门专题。
流式细胞仪一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本,在一定气体压力下将待测样品压入流动室,用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液)在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度,使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动,形成一个圆形的流束(即鞘流),待测细胞在鞘液的包裹下单行排列,依次通过流式细胞仪的检测区域,经激发光激发后产生荧光信号。
流式细胞仪通常以激光作为激发光源,经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT)接收。光散射信号在前向小角度进行检测,称为前向散射(forward～ atter,FSC),这种信号基本上反映细胞体积的大小;90°散射光又称侧向散射(side scatter,SSC),是指与激光束-液流平面垂直的散射光,其信号强度可反映细胞部分结构的信息。
荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机采集所测量到的各种信号进行计算处理,将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上，以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其x轴为测量的散射光或荧光的强度(可以是线性轴,也可以选择对数轴),纵轴为相对细胞数。
一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有256或1024通道数,这视其模/数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等。流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取,它通过分离含有单细胞的液滴而实现的。
在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体,可以产生高频振荡,使液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷,当带电液滴通过电场,在电场的作用下发生偏转,然后落入相应的收集器之中,从而实现细胞分选。流式细胞仪的分选速度从以往的5000个/s提高到现在的25000个/s。

03“流式细胞仪”基本结构
流式细胞仪主要由四部分组成，它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
1. 流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2. 激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
3. 光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
4. 计算机和分析系统

经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。

04“流式细胞仪”的分类

根据功能不同，可分为临床型和综合型（科研型）。
根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。
根据结构不同，可分为一般流式细胞仪（零分辨率流式细胞仪）和狭缝扫描流式细胞仪（高分辨率流式细胞仪）。
前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在3~5um。

05“流式细胞仪”的应用领域

流式细胞术的应用,简单用一句话概括就是,凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域,因为最初这个技术就是为此目的而设计的。
1、流式细胞术在细胞生物学中的应用
（1）染色体核型分析
用流式细胞术可将分离的染色体进行分类、纯化。传统的核型分析在取材、培养、涂片、固定后,用分带技术显示出不同染色体的特征信息,然后再显微照相,放大、剪接、组型。这是一个十分费时且不可避免掺有主观因素的技术。
目前,用仪器自动分型的方法,一是采用图像技术的静态方法,再有就是采用流式细胞术。后者除可做染色体分析外还可纯化,得到克隆实验所要求的染色体,这是其他任何技术都无法完成的,为此设计专门的特种流式细胞计。
（2）在分子遗传学领域中的应用　
流式细胞术的分析功能和分选功能在分子遗传学领域很有用处。分析的功能用来研究分离的染色体,有时也用来检测或定量测量细胞表面或内部为特异基因所编码的细胞分子;分选的功能可用来分选指定的染色体,然后用来建立人类染色体DNA文库。
（3）用于家畜性别的预选择　
将家畜的X、Y精子分选出来,达到控制胎畜性别的目的。此外,在精子发生学、睾丸瘤、不育症、药物对精细胞的干扰等研究中,都可使用流式细胞术进行定量研究。
（4）在微生物学中的应用　
流式细胞技术在真核细胞生物学方面,特别是哺乳类细胞学方面有重要贡献,在微生物学方面的应用则发展相对较晚。实际上,微生物学,尤其是细菌学当前面临的一些问题,特别是需要对大数量细菌进行逐个的快速多参数精确测量时,流式细胞术很适合解决此类问题。
已发表的论文多数是针对酵母菌和各类细菌的测量与分析。酵母菌的测量在技术上比较简单,它自身体积大,其DNA含量约为人类二倍体细胞DNA含量的1/200。已用定量DNA、RNA和光散射方法研究酵母菌的细胞周期。用同样方法和目的,也对原生生物、藻类和霉菌类以及各种重金属对其的影响进行研究。另外用FITC结合的抗血清可作种系鉴别,应用此项技术已能代替临床上经典的费时繁琐的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。
在工业中,流式细胞术可用于快速微生物鉴定,如对饮用水及原油中的微生物学鉴定与控制。
（5）在细胞周期研究中的应用
在生物细胞核中,DNA含量并非恒定,随细胞增殖周期时相不同而发生变化。G0期是第一次细胞分裂完成后进入第二次分裂开始前的阶段。G0期细胞是不参与细胞增殖的一群细胞,为静止期细胞,其细胞DNA含量为较恒定的二倍体(diploid)。
G1期指第二次分裂开始到本次DNA复制之前的过程,此期主要功能是积累能量和原料为DNA的复制做准备,故又称DNA合成前期。G1期细胞具有增殖活性,开始有RNA的合成;G0期和Gl期是细胞处于周期过程中两种不同功能状态时相的细胞,不能视为同一细胞,但就DNA含量而言,两者相同,均为二倍体DNA含量。S期又称DNA合成期,合成及复制DNA。当细胞进入S期后,DNA含量值逐渐从二倍体～四倍体增加,直到细胞DNA倍增结束,进入G2期。
G2期指从DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间,又称DNA合成后期或有丝分裂前期,此期合成大量蛋白质,为M期的细胞分裂做准备。
经过G2期后细胞最终进入M期,即有丝分裂期。在M期分裂为两个子细胞之前,G2期和M期的DNA含量均为恒定的四倍体细胞群。FCM分析细胞周期与DNA倍体时,需对DNA进行染色。
DNA荧光染料与细胞DNA双链的结合有一定量效关系,即DNA含量的多少与PI结合量成正比,因此通过荧光强度可以反映细胞内DNA的含量。
2、流式细胞术在医学中的应用
（1）在免疫学中的应用　
随着单克隆抗体技术、荧光色素化学等技术的发展,流式细胞术成为当代新技术的“杂交体”。正像免疫学作为一种不断发展的学科和技术手段延伸到生物、医学及其他领域一样,流式细胞术也以它的快速、灵活和定量的特点,广泛地被应用于免疫理论研究和临床实践应用的各方面,所以有人称之为现代免疫技术基石之一。
尤其同单克隆抗体结合应用,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面都起着相当重要的作用。
随着细胞学、病理学、免疫学、肿瘤学研究发展的需要、流式细胞测定技术也不断得到充实和完善。它不仅在功能上作为荧光显微镜的补充,而且因具备二者的全部功能和特点,从而在免疫及有关领域发挥出更重要的作用。20世纪80年代中期,国际上提出的白血病MIC分型法,标志着流式细胞仪及免疫分型在白血病诊断中的广泛应用。
我国自80年代中期引进该仪器,90年代迅速发展,现在已得到普遍应用。这期间免疫标记方法已发生很大的变化,由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法,从单色或双色到利用CD45抗体标记设门法进行多色免疫标记,使免疫分型的准确性得到很大的提高,现在已成为诊断白血病不可缺少的工具。
同时淋巴瘤的免疫分型与白血病免疫分型一样也已得到广泛开展。在获得性免疫缺陷综合症和“非典”的研究与治疗中FCM也发挥极大的作用。它通过对外周血中的CD4+ T淋巴细胞进行绝对记数,来反映病情进展及监测疗效。
（2）流式细胞术在肿瘤学上的应用　
利用FCM进行细胞周期分析、DNA倍体分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗和预防提供帮助。对肿瘤细胞DNA含量作定量分析,解析细胞周期,通过细胞异倍体测定预测各种肿瘤的预后,并能在化疗中对药物的选择和放疗中强度、时间的决定等起指导作用。
解析抗癌药物作用机制,对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定参考价值。此外,由于FCM对凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也发挥着重要作用,近年来引起肿瘤研究者的极大关注,已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中,为肿瘤诊断、疗效评价和预后预测提供重要参考指标。另外,传统的细胞形态学至今仍是诊断肿瘤的一种重要的手段。
多年来,细胞学工作者就设想使肿瘤细胞学诊断自动化,流式细胞术的问世,使细胞学检查自动化的宿愿如愿以偿,并已广泛应用于肿瘤临床细胞学的诊断研究。
大量的临床应用表明,流式细胞术对肿瘤细胞学的诊断正确率已达常规细胞学诊断水平。肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。肿瘤细胞的耐药性可分为原发耐药和继发耐药,前者在化疗前就存在于肿瘤细胞中,与用药无关,后者是由化疗药物诱导产生的,即在药物使用前对药物敏感,而在用药之后产生耐药。
继发耐药根据耐药谱的不同又可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)。MDR相关蛋白包括P糖蛋白、多药耐药相关蛋白等。它们都属于ATP酶活性转运蛋白,均是通过药物外排泵的作用降低细胞中药物的聚集。因此应用FCM检测肿瘤细胞的多药耐药相关蛋白的表达水平,对监测临床肿瘤化疗效果及药物的选择有一定意义。
（3）在血液学研究中的应用　
除上述FCM在白血病及淋巴瘤的免疫分型应用之外,它在血液学研究中有广泛的用途。如血小板记数、血小板自身抗体测定、血小板膜表面糖蛋白分析、血小板活化分析等。红细胞表面相关免疫球蛋白测定、红细胞血型抗原分析等。
3、流式细胞术新技术的应用
（1）液相芯片技术　
生物芯片技术是近年来随着人类基因组计划和蛋白质组计划的进展在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术,现已被大家所熟知。将生物芯片技术和FCM有机结合在一起,把不同生物探针(核酸、蛋白等)标记在各种有荧光的微球上,以荧光标记微球作为反应载体在液相系统中完成生物学反应,即为流式细胞术液相芯片技术。
它组成由微球体+探针+目的分子+报告分子的一种简单反应模式。可以在同一液相中同时检测多个目的分子。如对血液中多种白细胞介素检测。
（2）定量流式细胞分析　
定量流式细胞分析(quantitative flow cytometry QFCM)是指用流式细胞术对细胞或微粒上标记荧光分子的定量分析,从而对细胞的生物分子进行精确测量。如每个分子表达的平均分子数、抗原数等。
定量流式细胞分析不同于以往的相对荧光强度或阳性细胞百分率测量,它更为准确、灵敏。为FCM的发展趋势。如在获得性免疫缺陷综合症和“非典”的研究与治疗中,对外周血中的CD4+T淋巴细胞进行绝对记数,来反映病情进展及监测疗效。

06“流式细胞仪”的调试和使用

1. 调试和校准
流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。
激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。
液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节气体压力大小以获得稳定的液流速度。
测量区光路调节：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。
2. 仪器的操作和使用

①打开电源，对系统进行预热；
②打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；
③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；
④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；
⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；
⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；
⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；
⑧将所需结果打印出来。

07“流式细胞仪”的日常保养及故障排除

一、日常保养
由于该仪器比较昂贵且精密，操作人员使用不当就很容易使液流部位出问题，所以需要加强日常的保养工作。
1、所用溶液都要进行过滤处理，样本在上机前也要过滤，以免时间久了出现沉淀物而堵塞喷嘴。
2、开机后检测样本前，要用prime机检查喷嘴的畅通状况。
3、每日关机前移开托臂，用3～4管10%次氯酸钠反复冲洗，不要让有堵塞的喷嘴带病运行。
4、每天要倒空废液瓶内的废液，再注入少量的次氯酸钠或消佳净溶液，以防细菌生长。
5、鞘液瓶内的液体加至4/5容量并放置一夜，防止新加入的液体有气泡产生而影响检测结果。
二、常见故障排除
1、仪器长时间不能进入ready状态：这种情况可能是试管有裂缝导致漏气、鞘液罐的接口漏气、喷嘴上的胶圈破损及老化，或电源部分有故障，都应逐个排除。如果按上述方法也未能排除故障，需请厂家来维修。
2、喷嘴堵塞：该故障在操作中较多出现。日常的喷嘴在prime机时喷出一道水柱，如果喷出的是气泡，则说明喷嘴有堵塞，气泡越大堵塞越严重。
排除故障的步骤：
①放开托臂，用10%次氯酸钠反复冲洗再放回托臂机，如果故障还未排除就应关掉主机。
②用注射器接上胶管套，在喷嘴上反复抽吸，一般堵塞现象可以排除。
③如果注射器抽吸无效，则要取下喷嘴。此操作最好由厂家的维修人员或熟练的工作人员进行，以免撞弯了喷嘴。喷嘴用注射器套上冲洗，直至喷嘴喷出的水柱呈直线为止。
④如果喷嘴堵塞经上述3个步骤还不能解决，可以用超声波仪清洗。清洗时喷嘴两头应套上试管，以防碰弯。先将喷嘴浸入的10%次氯酸钠中超声1h，然后用过滤后的H2O再超声1h，经过此步骤清洗的喷嘴都会消除堵塞现象。
注意不到万不得己时不要拆下喷嘴清洗，因为反复的拆卸会增加喷嘴损坏的可能性。
实践证明，做好仪器的日常保养是保证检验质量的重要措施。喷嘴的堵塞问题尤其会影响DNA的图像，使测试结果无法分析。只有严格执行操作规程，才能使仪器达到最好的使用效果，发挥其最大的社会效益和经济效益。

08“流式细胞仪”的常见品牌

到了这里，相信各位已经对‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍流式细胞仪有很深的了解。如今，关于流式细胞仪都有哪些呢？最受关注的又是哪些呢？（按品牌简称首字母排序~）

A.安捷伦

产品：
Agilent NovoCyte 流式细胞仪
Agilent NovoCyte Quanteon 流式细胞仪等

▲ Agilent NovoCyte Quanteon 流式细胞仪

B.BD

产品：
BD FACSCanto II流式细胞仪
BD FACSCanton系列流式细胞仪等

▲BD FACSCanto II流式细胞仪

C.贝克曼库尔特

产品：
贝克曼库尔特CytoFLEX 流式细胞仪
贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪等

▲贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪

D.伯乐

产品：
伯乐流式细胞仪ZE5
伯乐流式细胞分选仪S3e等

▲伯乐流式细胞仪ZE5

E.Cytek

产品：
Aurora CS全光谱流式分选仪
Cytek NL-CLC全光谱流式细胞仪等

▲Aurora CS全光谱流式分选仪

F.德国美天旎

产品：
MACSQuant® VYB流式细胞仪
美天旎MACSQuant® X高通量流式细胞仪等

▲MACSQuant® VYB流式细胞仪

G. 富鲁达

产品：
CyTOF® XT™ 新一代质谱流式系统
Hyperion™ 组织成像质谱流式系统等
▲CyTOF® XT™ 新一代质谱流式系统

H.Luminex 路明克斯

产品：
Guava® easyCyte™微毛细管流式细胞仪
Amnis ImageStream X Mk II 量化成像流式细胞仪等
▲Guava® easyCyte™微毛细管流式细胞仪

I.迈瑞

产品：
迈瑞BriCyteE6 流式细胞仪等

▲迈瑞BriCyteE6 流式细胞仪

J. 赛默飞

产品：
Bigfoot全光谱流式细胞分选仪
Invitrogen Attune NxT流式细胞仪等
▲Invitrogen Attune NxT流式细胞仪

K.SONY

产品：
Sony ID7000全光谱流式细胞分析仪等

▲Sony ID7000全光谱流式细胞分析仪

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