Western Blotting（学习交流）

临床医师

Western Blotting，即免疫印迹，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，它结合了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的特异性。
其基本原理是：通过电泳将蛋白组分分开，然后将电泳后凝胶上的蛋白质转移至载体膜上，用封闭试剂封闭载体膜上未吸附蛋白质的区域，最后通过免疫学检测来分析特定的蛋白质表达水平。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其分辨率和灵敏度，广泛地应用于检测特定基因表达产物的正确性，或者比较表达产物的相对变化量。
1⃣️实验前准备
实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材，主要包括：各种凝胶配置液、各种缓冲液、相关抗体、PVDF 膜，赛默飞公司的 QSP 盒装吸头及 Nunc 冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器等。
主要仪器有：Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、离心机、电泳仪等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先制备蛋白样品，然后进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后凝胶上的蛋白质转移至 PVDF 膜上，接着对含有蛋白质的 PVDF  膜进行免疫学检测，X-胶片显影定影后，扫描图片，最后用 IPWIN6.0 软件分析结果。
2⃣️蛋白样品的制备
按 1ml 裂解液加 10 μl 的 100mmol PMSF，混匀后置于冰上待用。注意：PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，PMSF 是剧毒物质，操作时要谨慎。
蛋白样品一般来源于基因工程菌或特定的真核细胞，本实验以单层贴壁细胞总蛋白的提取为例。
倒掉离心管中的上清，用移液枪吸去残余培养液，注意不要吸走细胞。
每管细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂解，要经常上下颠倒离心管。
然后于 4℃ 10000×g 离心力离心 5min。
将离心后的上清分装转移至干净的离心管中，分装至少两份，放于-80℃保存。
蛋白质定量：按 BCA 蛋白质定量试剂盒操作说明进行操作，用 Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪于波长 562nm 处检测 OD 值，绘制标准曲线并计算样品蛋白浓度，取适量上清，加入上样缓冲液，煮沸10min。缓慢恢复至室温后，稍离心，放于-20°C 保存。
3⃣️SDS-PAGE 电泳
凝胶的制备
灌胶前，需组装好制胶器，将洗净且干燥的两块玻璃板底端对齐后安放在灌胶支架上。
参照 12%分离胶配制体系依次加入各个组分，混匀。将配置好的凝胶，沿玻璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡。根据梳子深度确定灌制高度，通常距离矮板至少2cm，灌好后，注入水封胶。
此时可按照配方配制 5%浓缩胶，注意 TEMED 在灌胶前再加入。
注意：AP 最好在配好一周内使用，TEMED 避光保存，分离胶和浓缩胶的Tris pH 值分别是 8.8 和 6.8。
静置一段时间待凝胶聚合，凝胶聚合后，弃去封胶溶液，并用吸水纸吸干。往浓缩胶里加入适量 TEMED，混匀后缓慢灌入到胶槽至矮板顶部，插上梳子，操作时避免产生气泡。
静置一段时间至凝胶聚合，拔下梳子，用蒸馏水冲洗胶孔。此时制好的胶可进行后续实验。
上样及电泳
安装电泳槽，注意确保内槽不漏缓冲液，往电泳槽加入足量电泳缓冲液， 缓冲液要没过玻璃板和凝胶。
吸取适量样品或者分子量标准 Marker，缓慢加入至胶孔。注意：加样太快会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时，要注意更换枪头，以免交叉污染。
上样完毕后，盖上电泳槽盖子，接通电源，设置电泳条件，一般浓缩胶 15mA， 分离胶 20mA，或恒压 100  -120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可关闭电泳仪停止电泳。
4⃣️转膜
将玻璃板从电泳槽中取出，用塑料切胶器在玻璃板的两边轻轻撬动，至到小玻璃板开始松动。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，注意不要把分离胶刮破。将剥出的胶浸于纯水中 5min，重复三次后放在转膜液中浸泡 10min。
PVDF 膜预先用甲醇浸泡 5min，然后将转印膜、印迹滤纸和海绵垫浸泡于转移缓冲液中 10min。膜和印迹滤纸的大小应裁剪至与胶的大小相当。在黑色面板上放置一层海绵垫，并依次放置至少 3 层印迹滤纸，凝胶，转印膜和至少 3 层印迹滤纸。放置膜时尽量一次性准确放置，凝胶与转印膜一旦接触就不要再移动，并记住膜与胶的接触面。玻璃试管轻轻滚压滤纸挤出气泡，并用海绵覆盖。关上转印夹，合上锁扣。安装好的转印夹应该使胶紧密地与 PVDF 膜接触而不被挤压。
将组装好的夹子装入转移电泳槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面。添加电泳缓冲液，盖好盖子，开启电泳仪，设置电泳条件，一般用 200mA 1-2h，或用恒压 100V 1-2h。注意：电泳转移时会产热，需要在电泳槽的一边放一些冰来降温。
转膜完成后，就进入免疫反应。免疫反应
印迹后的 PVDF 膜用 5%脱脂奶粉溶液室温孵育封闭１h，也可在 4℃过夜。将抗 Caspase 3 的鼠源单克隆抗体用一抗稀释液稀释至适当浓度，室温下孵育 PVDF 膜 1-2h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗 3 次，每次 10min，再用TBS 洗一次，10min。
将过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗或 X GAPDH 抗体按照适当比例用 TBS 稀释，室温下孵育 PVDF 膜 30min 至 1h用 TBST 于室温下脱色摇床上洗 3 次，每次 10min；再用 TBS 洗一次，10min。
ECL 化学发光与 X 光片定影
加入显色底物后按常规X 光片显影方法将转印膜上的信号转移至X 光片上。
5⃣️
5⃣️半定量结果分析
将定影后的 X 光片扫描保存为电脑文件，并用 IPWIN 6.0 分析软件对图片上每个特异条带灰度值进行数字化分析。具体操作如下：
打开 Image Pro Plus 软件，点击 File，打开结果图片。
首先进行光密度校对，点击 Measure，Calibration，点击 Intensity。在 Intensity Calibration 窗口中，点击 New，选中 Std.Optical Density，点击 Optical，点击 Imax ge，选择图中最亮的一点。然后点击 Ok，依次在新出现的对话框中点击 Ok， System，然后关闭小对话框。
点击 Measure，Count/Size，点击 Select Color，Color Cube Based，使用滴管将要分析的条带覆盖成红色，即 AOI，关闭窗口。点击 Measure，Select Measure， 选择 Area 和 IOD。在 Count/Size 窗口中，点点击 Select Color，Color Cube Based，使用滴管将要分析的条带覆盖成红色，即 AOI，关闭窗口。点击 Measure，Select Measure， 选择 Area 和 IOD。在 Count/Size 窗口中，点击 Options。Label Style 选择Measurement，可选择将 Area 或是 IOD 的值显示在各 AOI 上。点击 Ok，点击Count，即得到各 AOI 的 IOD 值。点击 View，Measurement Data，可见每个 AOI 对应的面积和累积光密度值。在 Statistics 窗口可查看面积和光密度的总值。
接下来进行数据处理：样品中目的蛋白的IOD 值除以内参X GAPDH  的IOD值，所得结果代表某样品目的蛋白的相对含量。
利用此软件，可以对一系列的梯度条带进行数字化分析和处理，如内参为 X GAPDH 的 CXCR four 的分析，内参为 β-Actin 的Caspase 3 的分析等。

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