Western blot 实验大忌——稀里糊涂跑内参蛋白

笑看风云

写在前面······
熊叔鸡汤：一门实验技术，不要因为成功了几次就沾沾自喜，也不要因为失败而妄自菲薄，搞清楚原理，切忌稀里糊涂，细节决定成败......
早年间刷论坛时一则帖子答复引人注目：不好好选内参的血泪史


组会上问某一位同学，你为什么内参用β-actin，答曰“大家都这么用！”，真是一口老血喷出….
所以熊叔今天就来讲讲内参为什么重要，重要在哪？以及如何选择内参。
<hr/>一、先弄明白为什么要设内参
生物体内存在一类基因，它们在各种组织、发育阶段、细胞周期状态或外部信号，都能稳定表达，对于维持生物功能是必须的，这类基因被称为“管家基因”（Housekeeping gene）。而管家基因由于这样能稳定表达的特性，被用作Western Blot和qPCR的内参。但实际上，由于实验条件以及组织类型等各种各样的限制，没有一种内参蛋白适用于所有样本。这个时候就需要我们根据实验条件及目标蛋白的分子量大小选择内参，有时候在整个课题研究过程中检测不同的蛋白可能需要更换不同的内参。
不设内参行么，当然不行。不论是Western blot还是qPCR，内参的设置首先能够反映出实验过程是不是正常，包括电泳、转膜、发光这些步骤有没有问题。这个时候，内参的作用是充当空白对照。
其次我们再谈定量的问题：我们跑Western blot除了想知道目的蛋白在细胞/组织中是否表达，更重要的是想知道表达量的高低。Western blot条带的灰度值能够帮我们判断目的蛋白的表达丰度，但前提是你最初的上样量是一样的，这个上样量指的可不是上样体积，而是你的蛋白浓度。所以我们需要内参来帮我们调整上样量，也就是用内参的信号来对目标蛋白的信号进行标准化。举个例子：
用药物处理细胞A和细胞B，如果收细胞时候细胞量基本相同，那么最后样品的蛋白浓度理论上大差不差，最后发光时在内参齐的基础上，我们再去判断目的蛋白的表达量差异：



EphA1 activation promotes the homing of endothelial progenitor cells to hepatocellular carcinoma for tumor neovascularization through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2016;35:65.

二、常用的内参有哪些
这部分我就简单来概括一下，想要单独详细了解某一蛋白的同学建议去GeneCards上仔细阅读：
1、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：是参与糖酵解的一种关键酶，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点的影响而保持恒定。
2、beta-actin（β-肌动蛋白）：actin是肌动蛋白，细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为6种，其中4种是具有肌肉组织特异性：alpaha1 (ACTC1，心肌，ACTA1，骨骼肌) ，alpaha 2 ( ACTA2, 主动脉平滑肌), gamma 2 ( ACTG2, 肠道平滑肌)。其余2种beta和gamma 1是两种非肌型肌动蛋白，广泛分布于各种组织中。beta-actin作为内参是得到了公认的，对于大多数组织和细胞来说，它广泛分布于细胞浆内，是已知最保守的蛋白质之一。
3、Tubulin（微管蛋白）：tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，分为有两种类型：α-tubulin和β-tubulin。
以上三种内参可以满足80%以上的WB实验需求
三、如何选择合适的内参
下面来讲讲选择内参的几个原则：
1、确定样本类型和靶基因亚细胞定位：
首先要考虑样本来源，是植物还是动物，是人还是其他物种。举例来说，肌动蛋白是高度保守的，来源于各种如人、小鼠和鸡的bet actin同源性是非常高的。但是像骨骼肌样本就不适用β-actin来作内参；同样道理，像文首提到的课题，缺氧和糖尿病这类的实验就不能拿GAPDH来作为内参，因为在这些细胞中GAPDH会存在高表达。



Hypoxia up-regulates SERPINB3 through HIF-2α in human liver cancer cells. Oncotarget. 2015;6(4):2206-2221.

其次我们要明确待检测基因的亚细胞定位，跑细胞总蛋白的Western blot一般用β-actin和Tubulin等细胞内较稳定表达的蛋白作为内参没什么毛病，但是核蛋白的内参要考虑用Lamin A，Lamin B，histone H3等；膜蛋白的内参一般用N-Cadherin。



EphA1 activation promotes the homing of endothelial progenitor cells to hepatocellular carcinoma for tumor neovascularization through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2016;35:65.

2、确定靶蛋白和内参的分子量
一般我们选择内参与要检测的蛋白分子量最好相差5kDa以上，所以我们要根据检测的蛋白的分子量来选择合适的内参。比如我们要检测的目的蛋白分子量大约为40kDa，这个时候最好就不要选β-actin和GAPDH作为内参，可以考虑用Tubulin作为内参。
3、明确实验条件和内参丰度
这个是什么意思呢，其实很好理解：你在给予某种处理的时候，你要考虑会不会影响内参的表达水平；其次你要考虑你选择的内参在你的样品中丰度是否过低，我们要选择稳定且高表达的蛋白作为内参。
这里我们来汇总几个例子：
a. 检测磷酸化等修饰型蛋白时，要选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin；
b. 细胞核的内参蛋白PCNA，在 DNA S 期表达，因此对于非增殖细胞不推荐使用
c. 检测多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定，而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；
d. 用缺氧、诱导糖尿病等处理时，由于GAPDH的表达增高，不能用来做内参；
e.做细胞增殖相关的实验时，c-Jun由于对细胞增殖、细胞存活与细胞凋亡等重要生理过程具有调控作用，自身表达会发生变化，不适合用来做内参；凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参
f.做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参比如Transferrin。



Proteomic profiling for plasma biomarkers of tuberculosis progression. Mol Med Rep. 2018;18(2):1551-1559

4、踩在巨人的肩膀上
如果你真的真的拿不定主意，最简单的方法就是看相关领域的paper，看人家用什么内参，思考为什么用这个内参（p.s. CNS为首选），顺便学学人家的解题思路。
在这里总结一个表格供大家参考：


四、跑内参时需要注意些什么
最后我们来聊聊怎样把内参跑的好看：
（1）首先很重要的一点就是配胶，胶孔配的歪歪扭扭，内参不可能跑的好看：


（2）由于内参蛋白在样本中表达量往往很高，所以上样量过多时，很可能导致最后发出来的条带一大坨，无法起到内参的标准化作用：


有时候我们必须提高上样量才能把目的蛋白条带发的好看，那这种情况下没有办法减少上样量怎么办，我们需要减弱内参的信号强度，一般最普通最简单的就是只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体。当发生上述情况时，你可以把二抗去掉，直接孵育偶联HRP抗内参抗体，大大减弱了抗体间的级联信号放大作用：


(3)当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Stripping缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测：


最后再给大家额外补充一个qPCR内参的数据库：
http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page
ICG数据库中收集了文献报道的各物种、组织细胞适用的内参基因。


好了，就写到这里，祝愿大家都能发出漂亮的内参，别忘了点赞、转发、关注我，让我有动力继续分享！我是老熊，一个立志用通俗易懂的语言带你玩转科研的忍者~

参考文献
[1] Hirano S. Western blot analysis. Methods Mol Biol. 2012;926:87-97.
[2] 林秋雄, 吴炳义. 生物医学基础研究使用手册[M]. 人民卫生出版社, 2021
[3] 陶永光. 肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册[M]. 湖南科学技术出版社, 2014.

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