protocol 分享｜细胞热转移实验（CETSA）

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CETSA（Cellular Thermal Shift Assay，细胞热转移实验）是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。
随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。其样品来源可以是细胞，也可以是组织，检测方法主要有免疫印迹（Western blotting）和蛋白质谱（MS）。
用途
直接监测完整细胞和组织样品中蛋白质相互作用状态的功能调节，也可用于验证某一药物与靶蛋白的结合关系。
材料与仪器
HEK 293T 细胞、PBS、DMSO、PCR 管
液氮等
步骤
1、将构建好的质粒瞬时转染到 HEK 293T 细胞中进行体内细胞热移实验 (CETSA)。
2、按照制造商的方案转染 HEK 293T 细胞 8 小时，随后将细胞暴露于 DMSO 或者 elaiophylin 中 24 小时，收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂 （1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail） 的 PBS 洗涤。对照细胞用相同体积的 PBS 孵育。
3、细胞培养计数后，用 PBS（含 1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail） 重悬至最终密度 2×107/ml。
4、然后将细胞分装于 7 根 PCR 管中，并在指定温度（37℃~67℃ 梯度）下在热循环器 (Bio-Rad, T100) 中加热 3 分钟以使蛋白质变性。
5、然后将细胞重悬于 NP40 缓冲液中，用液氮进行 3 次冻融循环。
6、4 ℃，20, 000×g 离心 20 min，收集上清。
7、往上清液中加等量的 2×SDS loading buffer，沸水灭活 10 min，取 20 μl，用 SDS-PAGE 凝胶进行 Western blotting（如果需要可切胶送公司做质谱分析）。
8、使用 GraphPad Prism 软件进行 CETSA 曲线分析，并进行达到 50% 温度 (Tm50) 值的热稳定性分析。
注意事项
第 6 步的离心需要在 4 ℃ 离心机中完成。
常见问题
在传统 Western blotting 操作过程中受跑胶，转膜，抗体孵育，显影等人工操作的影响，重复性会相对较差。建议先取少量样品跑一次预实验。
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