什么是荧光原位杂交中最关键步骤

奋斗的小鸟

荧光原位（FISH）技术： 是应用荧光染料标记的探针，与变性（68~90℃）后的染色体或细胞核靶DNA杂交(37~45℃),然后在荧光显微镜下观察并记录结果的技术
（一）应用
（1）染色体数目和结构异常的检测
（2） 基于扩增，基因缺失，基因断裂，基因融合的检测等
（二）探针检测流程
(1)样本的前处理：可以选择设备自动处理或者样本释放剂来进行手工处理
（2）变性杂交：把已经加了目的探针的样本置于杂交仪中杂交（变性85℃ 5分钟和杂交42℃2小时）
(3)洗片：2X SSC室温1分钟，68℃ FastProbe®洗液 2分钟；37 ℃纯水1分钟；晾干。
(4)复染：根据不同的要求选择合适的染液。
(三）样本类型及要求
组织样本：（手术组织切片 ，穿刺组织切片 ，肿瘤细胞块）固定4%中性甲醛固定6-72h 切片厚度：2-4um ，载玻片：粘附性载玻片
组织样本前处理各步骤原理及注意事项 ：
烤 片 ：8 0 ℃ ，3 0 m i n 或 者 6 5 ℃ ， 2 h 以 上 ； 使组织细胞更加紧紧粘附 ，然后续洗涤等 ，处理时不至于脱落80℃高温烤片时间不宜超过30min, 烤片时间长导致细胞形态被破坏。
脱 蜡 ：68℃脱蜡剂15min，需要提前30min预热脱蜡剂 ，温度到达68 后需要稳定15min再开始脱蜡 ，保证充分脱蜡 。
洗 涤 ：室温无水乙醇5min ；使无水乙醇液面高于脱蜡剂的液面 ，需要保证完全洗去玻片上的脱蜡剂 ，这样可以防止对后续实验的影响 。
通 透 ：90℃通透剂20min ,也需要提前 30min预热通透剂 ，再通透剂高温处理能除去蛋白交联，充分使DNA裸露出来，同时需要使细胞胀大和组织蓬松，这样细胞通透性变强,有利酶消化和探针杂交过程的完成 。
当通透温度不够或者时间不足，蛋白交联没有充分去除 ，细胞通透性不好，影响消化和杂交效果；如果通透时间过长细胞核会发涨 ，细胞黏就会在一起，最终都会影响细胞计数 。
洗 涤 ：37℃去离子水3min ；将玻片的温度降至到37℃，使去离子的水液面高于通透剂的液面 ， 这样可以保证完全洗去玻片上的通透剂 ，可防止对后续实的影响 。
消 化 ：37℃酶工作液 10-40min ；开始脱蜡时37℃预热蛋白酶工作缓冲液 (45ml ），在开始通透时加入10×蛋白酶溶液  5 m l ），充分混匀后继续预热15min再开始酶消化 ,这样可以保证酶活性最大 。 再根据切片厚度确定酶消化需要使用时间 ，一 般需要3μm消化20min，4μm消化20min之间，需要在显微镜观察确定酶消化程 。消化的目的是为了去掉组织和细胞上的蛋白质，这样有利于探针进入细胞核杂交 ，且可以降低背景 。
洗 涤 ：室温洗涤液选择（ 2XSSC ）漂洗2次，每次时间为5min；终止酶消化 ，可以防止酶对后 续实验的影响 ；
脱 水 ：在室温使用70% 、85%和100%梯度乙醇各2min ；
干 燥 ：室温晾干 。
（四）技术难点：
（1）前期固定对FISH的结果影响很大，固定不足会导致信号可能丢失，如果固定过长，会难以消化背景高。
(2)酶消化：消化组织上的蛋白质利杂交，降低背景 。不足会导致信号弱，组织界限不清 。过度会导致细胞破碎，信号丢失。


(3)变性不足：温度和时间不够，杂交信号差。
（4）杂交不足：温度不够会导致杂交信号差，杂点多。
（5）干燥：封片不好，液体蒸发，会导致背景高，信号差 。
（6）湿度过高：湿条水分过多会导致信号弱。


杂交后洗脱 ：时间过长，信号减弱。 当时间过短背景高杂信号 ，不合适的洗涤液和条件，信号变弱/背景高/杂信号。


总结:样本的处理是实验成功的关键步骤

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