用 ImageJ 测量荧光强度的3种方法

会里很

荧光实验完成后得到的图片只能通过肉眼观察荧光强弱，如何将荧光强度数值化呢？可以通过 ImageJ 进行平均荧光强度半定量分析，方法有多种，这里分享3种简单的方法。
ImageJ 安装包：顶级图像分析工具，ImageJ、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定全部！
对于一张单通道（单色）的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen) / 该区域面积(Area)
测量参数设置步骤

打开ImageJ，菜单栏选择Analyze→Set Measurements。
在下图右侧所示弹出的选项框中，勾选我们需要的参数：
Area：所框选区域面积
Mean：框选区域平均灰度值
Integrated Density：IntDen，框选区域荧光总强度

选择好测量参数之后点击OK。


方法一：RGB measure

原理是直接测量RGB三原色，这种方法建议框选的区域尽量小，可以把图片放大再框选，这样测量结果数值比较大，误差小。


ImageJ内打开需要分析的荧光图片，File-Open


选择菜单栏的矩形选框，框选荧光团，然后点击菜单栏Plugins--Analyze--Measure RGB。
如果多个位置或者多个图片需要分析，重复以上步骤即可。
Edit→Copy，将数据拷贝到Excel表中进行后续的数据整理。


方法二：ROI Manger

打开ROI Manger面板后，勾选Show All及Labels



<hr/>打开需要分析的荧光图片，点击菜单栏Analyze--Tools--ROI Manager，在打开的ROI Manager面板内，点击Add，将图片添加至分析面板内。
按照上述步骤框选其它区域或添加其它需要分析的图片
点中面板内的图片名称后选择Rename，可以对该对象重命名，之后点击OK确定。


Edit→Copy，将数据拷贝到Excel表中。


细心的友友可以发现，同样的2张荧光图以及同样的区域，ROI Manger分析的荧光强度和RGB measure分析的结果不一样，是不是分析的结果有问题？
2种分析方法的结果都是对的，但是ROI Manger这个方法分析的荧光强度是相对值。
方法三：转化灰度图，调阈值，选中荧光

这种方法和之前分享的用image j定量分析免疫组化图的步骤一致。
打开分析图片，菜单栏Image--Type--8bit，图片由彩图变为灰度图。


Image→Adjust→Threshold，调阈值，去除背景，选中荧光，之后点击set，ok


菜单栏点击Analyze-Set measurements，调整参数。
菜单栏选择Analyze-Measure，得出结果。


注意：RNA FISH或免疫荧光是半定量分析，平均荧光强度只能半定量地表征RNA或特异性蛋白的表达。主要是因为免疫荧光实验中的人为因素太多，例如拍照时的曝光、焦距等等，而且非特异性结合的因素也不能完全消除。所以我们在拍照的时候，以及处理数据的时候，一定要有一个固定的标准和流程，从而减小误差。

Image j 其它教程汇总：

• 顶级图像分析工具，ImageJ、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定全部！
  
• ImageJ一键合成靠谱的多色荧光图
  
• 用imagej  免疫组化及荧光强度的分析？
  
• 如何用 ImageJ 分析脑缺血面积百分比？
  
• ImageJ 分析划痕面积和划痕平均宽度
  
• ImageJ 分析 Western blot 灰度值
  
• 技能爆发！快速用Image J定量分析免疫组化图！
  
• 绝了，拯救细胞计数，ImageJ 的3个细胞计数法！
  

科研必备软件/资源汇总

最全的生物实验protocol与生物实验操作视频学习资料           
112个科研软件免费版（数据处理+绘图+翻译+生物实验相关等）         
下载链接：https://pan.quark.cn/s/34a75dd2

绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！
如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？
有哪些好用的zotero插件?
有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？
有没有什么很好的科研作图软件？
顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！
NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）
2023年更新！EndNote X9永久激活版本（序列号激活），最稳定，可汉化！
写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！
太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！
western blot是为了什么？
如何学习和记忆细胞信号通路？
最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！
SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年
​

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/713263014