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    小桔灯网»社区 › C、IVD技术区 › 流式细胞技术 › 流式细胞术可以用来测定什么？

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    [分享] 流式细胞术可以用来测定什么？

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    莺歌燕舞
    发表于 2024-10-20 12:08 | 显示全部楼层 |阅读模式

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    流式细胞术可以用来测定什么？
    原文地址：https://www.zhihu.com/question/398341055
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    发表于 2024-10-20 12:08 | 显示全部楼层

    什么是流式细胞术？
    流式细胞术（Flow Cytometry，FC）是一种基于荧光的，在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，例如细胞群计数和蛋白丰度等。流式细胞术结合细胞分选仪还可以进一步把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术,该过程称为荧光激活细胞分选法 (FACS)。流式细胞技术在细胞生物学、细胞凋亡研究和免疫学方面起着非常重要的作用。
    流式细胞仪如何工作？
    在流式细胞术中使用的仪器称为流式细胞分析仪，通常缩写为“细胞分析仪”。流式细胞分析仪由一个用于进行细胞处理的流体系统和一个包括数据采集信号检测器和处理器的光学系统组成。
    关于流式细胞仪更详细的工作原理，点击以下视频了解。
    流式细胞实验中如何选择合适的抗体？

    在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响着实验的数据质量。随着流式细胞术的日益发展，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，如何选择合适的流式抗体，也成为了流式技术是否能成功的关键因素之一。
    Biorbyt 在本篇文章中就来聊聊流式抗体选择的小技巧。
    1）确定抗体基本信息

    • 确定所需检测的指标，目的细胞的特异性表面标记或胞内标记；
    • 根据检测样本的种属选择可适用的抗体；
    • 根据抗体的说明，明确是否可以用于流式实验。
    2）确定所使用仪器的参数配置

    • 激光器：不同的流式细胞仪激光器不同，常见的有405nm，488nm和635nm，需要根据具体的仪器进行确定。
    • 滤光片：检测通道的多少，决定最多可以同时检测几个指标。荧光素的发射波长与滤光片有关，所选择荧光素要在仪器的可检测范围内。
    • 仪器：相同的荧光在不同的仪器上检测通道可能不同，需要参照仪器的说明。
    3）荧光素的选择

    • 抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光，如PE、APC。
    • 抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC。
    • 常用荧光强弱排序程度为：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC
    4）多色荧光搭配

    • 同时检测几个指标时，就需要多个荧光标记进行搭配。流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。
    • 注意所使用的仪器有哪些激光，每个激光检测通道只能选择1种荧光素，各通道之间的荧光素可以随意搭配，检测通道不能冲突。
    • 如果需要做多个指标，而流式细胞仪能检测的通道不够，科研将指标归成2类，再将样本分成2份，分别进行检测。
    • 所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致较大的补偿。例如，PE-Cy5与APC同时标记，将会导致补偿过度，需换成PE-Cy5.5或PerCP-Cy5.5。
    5）同型对照抗体的选择

    • 同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，类似于阴性对照，是流式细胞实验不可或缺的一项。
    • 同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1)，同型对照则为Mouse IgG1-FITC.
    • 如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体，如纯化的CD3+PE标记的二抗，则对照为纯化的同型对照+ PE标记的二抗。
    • 有时候同型对照的表达会比抗体的表达高，首先检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。
    6）直接法与间接法染色的选择

    • 直接法：即使用直接偶联抗体，可直接多重分析来自同一宿主的抗体。由于孵育和洗涤步骤更少，因此实验步骤更快，并且能够在一项检测中使用许多不同的抗体，从而能够同时读取大量终点。
    • 间接法：即使用非偶联一抗 + 偶联二抗，可改善以低丰度存在的靶标的检测，同时由于二次放大可提供更高的灵敏度（多个二抗结合一个一抗）。当直接偶联物尚未获得时，有助于一抗的初始验证。
    Biorbyt 可以提供各种研究领域蛋白指标的流式细胞检测抗体，以下是近期热销产品列表，欢迎咨询！


    Catalog  No.Product  NameApplications
    orb500265Smad3  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb526646Akt1  (phospho-Ser473) antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb559171YAP1  (phospho-Ser127) antibodyFC,WB
    orb612211TNFR2  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb704335Wnt2b  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb704345LYVE1  antibodyICC,FC,IHC-P
    orb704355Alpha  Smooth Muscle Actin antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb499643Beta-Actin  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb525868CD19  antibodyFC
    orb182468CD163  antibodyICC,FC,WB,IHC-P,IF
    orb182470CD4  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb182473Cryopyrin  antibodyFC
    orb182660Contactin  1 antibodyFC
    orb182936Cardiac  Troponin T antibodyICC,FC,IHC-P
    orb183142DNAH5  antibodyFC
    orb183268beta  Defensin 3 antibodyFC,IF
    orb183495NeuN  antibodyICC,FC,IHC-P,IF
    orb183601FAM38A  antibodyICC,FC,IHC-P,IF
    orb184006HPV16  E7 antibodyFC,WB
    orb184283CD41  antibodyFC
    orb184816KAAG1  antibodyFC
    orb184818KAP1  (phospho-Ser473) antibodyFC,IHC-P
    orb184851LAPTM5  antibodyFC
    orb185667Occludin  antibodyFC,WB
    orb186433Tropomyosin  (phospho-Tyr490) antibodyFC,WB
    orb186439TNNI3  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb186927CHRAC1  antibody (FITC)FC
    orb187072CHI3L1  antibody (FITC)FC,IF
    orb187180Claudin  5 antibody (FITC)FC
    orb187808NeuN  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb187914FAM38A  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb188680Insulin  Receptor (phospho-Tyr999) antibody (FITC)FC,IF
    orb189165LAPTM5  antibody (FITC)FC
    orb189951Nephrin  antibody (FITC)FC
    orb312158Activated  Notch1 antibodyFC,WB,IHC-P
    orb312168ALPPL2  antibodyFC,IHC-P
    orb312182CLEC2  antibodyFC
    orb312217DRP1  (phospho-Ser616) antibodyFC,IHC-P
    orb312227alpha  Elastin antibodyFC,WB,IHC-P
    orb312249ganglioside  GM1 antibodyFC,IHC-P
    orb312397NEP1-40  antibodyFC
    orb312399NFKB  p65 antibodyFC,WB,IHC-P
    orb312400NFKB  p65 antibodyFC,IHC-P
    orb312509PKM2  (phospho-Tyr148) antibodyFC
    orb312830PCDH7  antibodyFC,WB
    orb312831beta  1 Adrenergic Receptor antibodyFC,WB
    orb313249TREM2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb317567CD19  antibodyFC,IHC-P
    orb317598CD68  antibodyFC,WB,IF
    orb317686NFKB  p65 antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb317701PPARGC1A  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb317880SLC15A3  antibodyFC
    orb483321HB9/HLXB9  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb483598PPAR  Gamma antibody (PE)FC,IF
    orb10037ACTA2  antibodyFC,WB
    orb10039AD7C-NTP  antibodyFC,WB,IHC-P,ELISA
    orb10059AEBP1  antibodyFC,IHC-P
    orb10068F-Actin  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10101Annexin  V antibodyFC,WB,ELISA
    orb10124Aquaporin  3 antibodyFC,IHC-P
    orb10143MASH1/Achaete-scute  homolog 1 antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb10158ATP7A  antibodyFC,IHC-P
    orb10181BDNF  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10186FGF2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10277Interferon  gamma antibodyFC,IHC-P,IF
    orb10289Syndecan  1 antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10295CD28  antibodyFC,IHC-P
    orb10305CXCR4  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10309CD24  antibodyFC,WB
    orb10313CD3  antibodyFC,WB,IF
    orb10371CEBP  beta antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10380Chat  antibodyFC,WB,IHC-P,IHC,IF
    orb10393c-Jun  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10399pan  Cytokeratin antibodyICC,FC,WB,IHC-P,IF
    orb10496Cyclin  D1 antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb10514Dopamine  D1 receptor antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10573HPV16  E7 antibodyFC
    orb10581EGF  antibodyICC,FC
    orb10670FOXP3  antibodyFC,IHC-P
    orb10681GAD67  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10684DDIT3  antibodyICC,FC,WB
    orb10726GLUT2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10740GPR30  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb10837HPV16  E6 protein antibodyFC
    orb10839HPV16-E7/E7  antibodyFC
    orb10855TRT  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb10863AIF1  antibodyFC,WB,IHC-P,ELISA
    orb10917CD127  antibodyFC,WB
    orb10927Integrin  alpha 5 beta 3 antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10952ATP1B2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb10973OxLDL  antibodyFC,IHC-P
    orb10982GPR49  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb11009CD11b  antibodyFC,IHC-P
    orb11040Mfn1  antibodyFC
    orb101049MMP-2  antibodyICC,FC,WB
    orb11082Mesothelin  antibodyFC,WB,ELISA
    orb11118NFkB  p65 antibodyICC,FC,WB,IHC-P,IF
    orb11125NGF  Receptor antibodyFC,WB
    orb11163GRIN2D  antibodyFC
    orb11184OCT4  antibodyFC,WB
    orb11190RANKL  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb11192Osteopontin  antibodyFC,WB,IHC-P,IF
    orb11201CDKN2A  antibodyFC,IHC-P
    orb11203p21  antibodyICC,FC,IHC-P
    orb11225PAF  Receptor antibodyFC,IHC-P
    orb11256PDGF  Receptor alpha antibodyFC,IHC-P
    orb11372SIRT1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb11384Smad2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb11407Surfactant  Protein D antibodyFC,IHC-P
    orb106147STAT3  (phospho-Tyr705) antibodyFC,WB,IHC-P
    orb11470TGF  beta 3 antibodyFC,WB,IHC-P
    orb11472TGF  beta Receptor I antibodyFC,WB,IHC-P,IF
    orb11489TLR4  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb11501TPO  antibodyFC
    orb11506TNF  Receptor II antibodyFC,WB
    orb11522TRX  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb11559Vimentin  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb11580XBP1  antibodyICC,FC,WB
    orb15046F-Actin  antibody (FITC)FC
    orb15056Adiponectin  Receptor 2 antibody (FITC)FC,IF
    orb15062Adenosine  Receptor A3 antibody (FITC)FC,IF
    orb15065ADRB2  antibody (FITC)FC,IF
    orb15126Aquaporin  9 antibody (FITC)FC
    orb15268CCR7  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb15344CDK4  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb15391pan  Cytokeratin antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb15501Desmin  antibody (FITC)FC
    orb15659GFAP  antibody (FITC)FC,IF
    orb15756HIF2  alpha antibody (FITC)FC,IF
    orb15948LC3  antibody (FITC)FC,IF
    orb15949MAP2  antibody (FITC)FC,IF
    orb15955MBP  antibody (FITC)FC,IF
    orb16133CDKN2A  antibody (FITC)FC,IF
    orb16252Profilin  1 antibody (FITC)FC,IF
    orb16404TGF  beta Receptor 1 antibody (FITC)FC,IF
    orb16446TrkB  antibody (FITC)FC,IF
    orb16451TRX  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb16490Vimentin  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb132285HT4  Receptor antibodyFC,WB,IHC-P,IF
    orb13306CD226/DNAM-1  antibodyFC,WB
    orb13313SLAMF9  antibodyFC,WB
    orb13317CD9  antibodyFC,WB
    orb13342Cytokeratin  7 antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb13385EAR1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb13390EIF4E1  (phospho-Ser209) antibodyFC,WB,IHC-P
    orb13426CXCL13  antibodyFC,WB,IHC-P,IF
    orb13496IL15  antibodyICC,FC,IHC-P
    orb13514Integrin  alpha 1 antibodyFC,WB
    orb13515Integrin  Alpha V + Beta 1 antibodyFC,WB
    orb13540LEF1  antibodyFC,WB
    orb13563MCP1  antibodyFC,IHC-P
    orb13605Neuritin  antibodyFC,WB
    orb13641PD1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb13645PERK  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb13652Polycystin  1 antibodyFC
    orb13678ROS  antibodyFC,WB
    orb13722TLR1  antibodyFC
    orb13739UCP1  antibodyFC,WB
    orb13740UCP2  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb13821BAFF  antibody (FITC)FC,IF
    orb13894SMMHC  antibody (FITC)FC
    orb13919CYP3A4  antibody (FITC)FC,IF
    orb13948EAR1  antibody (FITC)FC,IF
    orb14085Klf4  antibody (FITC)FC,IF
    orb14198PD1  antibody (FITC)FC,IF
    orb14246SREBP2  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb15031PPAR  alpha antibodyFC,WB,IHC-P
    orb56454EBP1  (phospho-Thr37/46) antibodyICC,FC
    orb4401BACH1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb4691BMI-1  antibodyFC,WB
    orb5888CLEC2D  antibodyFC
    orb5872CK19  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb5845PBR  antibodyFC,IHC-P
    orb5211FAK  (phospho-Tyr576/577) antibodyFC,WB,IHC-P
    orb6097Glucose  6 phosphatase alpha antibodyFC,WB,IHC-P
    orb6078GCN2  (phospho-Thr899) antibodyFC
    orb5384TIM1  antibodyFC
    orb6159Tri  Methyl-Histone H3 (K27) antibodyFC
    orb5482HSP27  (phospho-Ser82) antibodyFC,IHC-P
    orb5499IFNAR1  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb99035LRP1  (phospho-Ser452) antibodyFC,IHC-P
    orb6173Lrp2  antibodyFC,IHC-P
    orb5651Btk  (phospho-Tyr223) antibodyFC,IHC-P
    orb6019NR1D1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb6191HMGCR  (phospho-Ser872) antibodyFC,WB,IHC-P
    orb6232IRF7  antibodyFC,IHC-P
    orb6328CD91  antibodyFC,IHC-P
    orb6344CD103  antibodyFC,WB
    orb6419MEF2D  (phospho-Ser444) antibodyFC,WB
    orb6424MLK3  (phospho-Thr277/Ser281) antibodyFC,IHC-P
    orb6519eNOS  (phospho-Ser1177) antibodyFC,WB
    orb6544Nrf2  (phospho-Ser40) antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb6571CDKN1A  (phospho-Ser130) antibodyFC,IHC-P
    orb6786PKR  (phospho-Thr446/451) antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb6979Smad2  (phospho-Ser465/467) antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb7067Tau  protein (phospho-Thr205) antibodyFC,WB
    orb7086TGF  Beta 1(CT) antibodyFC,WB,IHC-P
    orb7087TGF  Beta 1 antibodyFC,WB,IHC-P,IF
    orb7128Tubulin  alpha 6 antibodyFC,WB,IHC-P
    orb7143CD21  antibodyFC,WB
    orb8720CK19  antibody (FITC)FC,IF
    orb8717CK10  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb7831CREM  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb8063FAK  (phospho-Tyr925) antibody (FITC)FC,IF
    orb8550Vitamin  D Binding protein antibody (FITC)FC
    orb7235SOX9  antibody (FITC)FC,IF
    orb9072IRF3  antibody (FITC)FC,IF
    orb9097Jak1  (phospho-Tyr1022/1023) antibody (FITC)FC
    orb9176CD91  antibody (FITC)FC,IF
    orb9301mTOR  (phospho-Ser2481) antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb9314MyoD1  (phospho-Ser200) antibody (FITC)FC
    orb9715RECK  antibody (FITC)FC,IF
    orb9766Rabbit  Anti-Sca1 (FITC)FC,IF
    orb9848SP-C  antibody (FITC)FC
    orb9909Tau  protein (phospho-Thr231) antibody (FITC)FC
    orb9944TLR6  antibody (FITC)FC,IF
    orb6174Collagen  IV antibodyFC,IHC-P
    orb11061MMP2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb101887ACPT  antibodyFC
    orb101745IL1  beta antibodyFC,WB,IHC-P
    orb101675TdT  antibodyFC,IHC-P
    orb101668CD16  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb101636FAPA  antibodyFC,IHC-P
    orb101303HAS  antibodyFC,WB
    orb100708MFSD2A  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb100539Bone  Alkaline Phosphatase antibodyFC
    orb100329TNFR1  antibodyFC,WB
    orb100289Integrin  Alpha V/Beta 6 antibodyFC,WB
    orb100194EDG3  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb100121PCSK9  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb102042ADORA2B  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb102419CYP2E1  antibody (FITC)FC,IF
    orb102500EDIL3  antibody (FITC)FC
    orb102575FAPA  antibody (FITC)FC,IF
    orb102620Frizzled  1 antibody (FITC)FC,IF
    orb102715HDLBP  antibody (FITC)FC
    orb102779ICAM4  antibody (FITC)FC,IF
    orb103060Myosin  VIIa antibody (FITC)FC,IF
    orb103138Nucleoporin  p62 antibody (FITC)FC,IF
    orb103247Plzf  antibody (FITC)FC,IF
    orb1117Geminin  antibodyFC,IHC-P
    orb1179CD45  antibodyFC,WB
    orb1255UBE2Q1  antibodyFC
    orb1265Arginase  1 antibodyFC,IHC-P
    orb1532Nitrotyrosine  antibodyFC,WB
    orb1777Dlx1  antibodyFC
    orb1860pIRF3  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb1868CD71  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb1869FOXN1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb1926IGSF9  antibodyFC
    orb2059MSX1  antibodyFC,WB
    orb2101PPAR  Gamma antibodyFC,WB,IHC-P
    orb2250TRAP  antibodyFC,WB
    orb2664FL  393 antibodyICC,FC,WB,IHC-P,ELISA
    orb2733RNF123  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb3009CXorf21  antibodyFC
    orb3644Neutrophil  Elastase antibody (FITC)FC
    orb3898CD71  antibody (FITC)FC
    orb3910pTrkA  antibody (FITC)FC,IF
    orb499146FCGRT  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb499317Dopamine  D2 receptor antibody (PE)FC,IF
    orb499522CD206  antibody (PE)FC
    orb499560Cryopyrin  antibody (PE)FC,IF
    orb499606BTN2A1  antibodyFC
    orb499639IL-1R1  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb499655PPAR  Alpha antibodyFC,WB,IHC-P
    orb499679SOD2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb499694AD7c-NTP  antibodyFC
    orb499738CD90  antibodyFC,WB
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    orb500678LRRK2  antibodyFC,IHC-P
    orb500732NKG2D  antibodyFC,WB
    orb500740SOX10  antibodyFC,IHC-P
    orb500812Ki-67  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb500824GPR30  antibodyICC,FC,WB,IHC-P
    orb500829GFAP  antibodyFC,WB,IHC-P,IF
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    orb500942CD11c  antibodyFC,WB
    orb501007Cox2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb502710DRP1  (phospho-Ser616) antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb504819p70  S6 Kinase Beta (phospho-Thr389) antibody (PE)FC
    orb505121BNIP3  (Phospho-Ser95) antibody (PE)FC
    orb505547EGFR  (phospho-Tyr1068) antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb505631FoxO1  (phospho-Ser256) antibody (PE)FC,IF
    orb505720REV-ERB  alpha (phospho-Ser55/59) antibody (PE)FC
    orb505918FAK  (phospho-Tyr925) antibody (PE)FC,IF
    orb505973RUNX2  (phospho-Ser451) antibody (PE)FC
    orb506137Beta-Catenin  (phospho-Ser552) antibodyFC
    orb506147PERK  (phospho-Thr980) antibodyFC,WB,IHC-P
    orb155740ASCL2  antibodyICC,FC
    orb155807BCL2  (Phospho-Ser87) antibodyFC,IHC-P
    orb156292CCL26  antibodyFC,IHC-P
    orb156359CHRM4  antibodyFC,WB
    orb156402CLIC6  antibodyFC
    orb156486CTLA4  antibodyFC
    orb156726EMR1  antibodyFC,WB
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    orb156945Fragilis  antibodyFC
    orb156973FXR  antibodyFC,WB
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    orb1184460CD69  antibody (FITC)FC
    orb157302GPR110  antibodyFC,WB
    orb157428HAPLN3  antibodyFC
    orb157435HB9  antibodyICC,FC,WB
    orb1184523IL-4  antibody (APC/Cy7)FC
    orb157743Keratan  Sulfate antibodyFC,WB
    orb157860MCT1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb157917Musashi  1 antibodyICC,FC,IHC-P
    orb158462SOX4  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb158576TBR2  antibodyFC,IHC-P
    orb158598THRB1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb158607TIFA  antibodyFC,IHC-P
    orb158655TRPV6  antibodyFC,WB
    orb158714Vimentin  antibodyICC,FC,WB,IF
    orb155585ACTA2  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb484364Frizzled  1 antibody (PE)FC,IF
    orb484458Frizzled  5 antibody (PE)FC,IF
    orb484899PDE5A  antibody (PE)FC,IF
    orb485167CD170  antibody (PE)FC,IF
    orb485179CLEC2D  antibody (PE)FC,IF
    orb485226Histone  2AX antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb485585MC1  Receptor antibody (PE)FC,IF
    orb485741MADH7  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb485757Synaptophysin  antibody (PE)FC,IF
    orb485787PDGF  A antibody (PE)FC,IF
    orb485798Substance  P Receptor antibody (PE)FC,IF
    orb485838IL1  beta antibody (PE)FC,IF
    orb485900FGFR2  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb485929Desmin  antibody (PE)FC
    orb485949CD10  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb485955CD20  antibody (PE)FC
    orb485978GLUT1  antibody (PE)FC,IF
    orb487111TRPV6  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb487192TRPV5  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb487237Calcitonin  receptor antibody (PE)FC
    orb488732MSGN1  antibody (PE)FC
    orb490178ALPPL2  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb490863NG2  antibody (PE)FC
    orb491176SOCS3  antibody (PE)FC,IF
    orb491183Nurr1  antibody (PE)FC,IF
    orb491286BTN2A1  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb491300Synaptopodin  antibody (PE)FC
    orb491535PCDH7  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb492352METRNL  antibody (PE)FC
    orb493558FAM105B  antibody (PE)FC
    orb493841Galectin-1  antibody (PE)FC,IF
    orb493916LPA2  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb494806Fragilis/IP15  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb495013METRN  antibody (PE)FC
    orb4950755-Lipoxygenase  antibody (PE)FC,IF
    orb495188GFAP  antibody (PE)FC,IF
    orb495270p21  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb495275Vip  Receptor II antibody (PE)FC,IF
    orb495322STAT5  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb495392CCR7  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb495404ZO-1  antibody (PE)FC,IF
    orb495416NRF1  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb495426Granzyme  B antibody (PE)FC,IF
    orb495512CD33  antibody (PE)FC
    orb495598FOXJ1  antibody (PE)FC,IF
    orb495625MKP-2/DUSP4  antibody (PE)FC,IF
    orb495793CK19  antibody (PE)FC,IF
    orb495861Myosin  light chain antibody (PE)FC
    orb496312Neuroligin  1 antibody (PE)FC
    orb496784Biglycan  antibody (PE)FC
    orb497141RAG1  antibody (PE)FC,IF
    orb498451SOX4  antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb499007SULF1  antibody (PE)FC,IF
    orb499027Rabbit  Anti-Sca1 (PE)FC,IF
    orb499041HER2  antibody (PE)FC,IF
    orb499090PDGF  B antibody (PE)FC,IF
    orb499099Mesothelin  antibody (PE)FC
    orb499101N  Cadherin antibody (PE)ICC,FC,IF
    orb463034SLC34A3  antibody (FITC)FC
    orb463588IL-1R1  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb463625CD19  antibody (FITC)FC
    orb464231Nurr1  antibody (FITC)FC,IF
    orb464334BTN2A1  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb464413PCDH7  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb464951CD200R  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb464992DAP12  antibody (FITC)FC,IF
    orb465963CD147  antibody (FITC)FC,IF
    orb466005MADH7  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb466068IL1  Receptor 2 antibody (FITC)FC,IF
    orb466729EN1/Engrailed  1 antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb466849iNOS  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb466860CD11c  antibody (FITC)FC
    orb466967beta  1 Adrenergic Receptor antibody (FITC)FC,IF
    orb124537CD69  antibody (PE)FC,IF
    orb124560Cox2  antibody (PE)FC,IF
    orb124566CXCL10  antibody (PE)FC,IF
    orb124596EAR1  antibody (PE)FC,IF
    orb124701Integrin  alpha 5 beta 3 antibody (PE)FC,IF
    orb124805PAF  Receptor antibody (PE)FC,IF
    orb461433Cathepsin  B antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb461506Nogo  A antibody (FITC)FC,IF
    orb461618IGF1R  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb462375GPR110  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb462503GPCR  EX33 antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb462617TRPV6  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb462681PLAC8  antibody (FITC)FC
    orb222130MDR1  antibody (FITC)ICC,FC,IF
    orb526360CD14  antibodyFC
    orb526772SLC25A18  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb544598NCR1  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb612166PAX6  antibodyFC,WB,IHC-P
    orb704537IRS1  (phospho-Tyr1229) antibodyICC,FC,IHC-P
    orb868319Rabbit  Anti-Mouse IgG H&L/FITC antibodyFC
    orb868396Mouse  Anti-Human IgM antibody (Cy5)FC
    orb868531Goat  Anti-Rat IgG H&L antibody (Cy5)FC
    orb868595Goat  Anti-Rabbit IgG H&L antibody (PE-Cy5)FC
    orb868831Rabbit  Anti-Bovine IgM antibody (FITC)FC
    orb871516Anti-IL-1  Beta/PE-Cy5FC
    orb878042Anti-MARCH9/PE-Cy7FC
    orb879446Anti-IRAK1/PE-Cy7ICC,FC
    orb880682Anti-phospho-HNF4  (Ser304)/PE-Cy7FC
    orb881904Anti-PPAR  Gamma/PE-Cy5.5FC
    orb891238Anti-FAPA/Cy5FC,IF
    orb891331Anti-Neuritin/PE-Cy5FC
    orb891519Anti-Polycystin  1/PE-Cy5ICC,FC
    orb892191Anti-Ferritin  Heavy Chain/FTH1/PE-Cy7ICC,FC
    orb899278CD11b/PE-Cy5  antibodyFC
    orb899559Anti-Caveolin-3/Cy5FC,IF
    orb899751Anti-PXR/PE-Cy5.5FC
    orb901017Anti-CD1d/PE-Cy5.5FC
    orb902613Phospho-PERK(Thr980)/PE-Cy7  antibodyFC
    orb905794Anti-CD170/PE-Cy5.5FC
    orb909518Anti-CCR10/PE-Cy7FC
    orb909815Anti-Thioredoxin/Cy5ICC,FC,IF
    orb910370Profilin  1/PE-Cy5.5 antibodyFC
    orb911309Anti-BRG-1/PE-Cy7FC
    orb913013Anti-KRAS/Cy5FC,IF
    orb913028Anti-IL12/PE-Cy5.5FC
    orb913704Anti-BLBP/Cy5FC,IF
    orb913879Anti-GFAP/Cy5FC,IF
    orb914484Anti-Nestin/PE-Cy7ICC,FC
    orb915495Anti-CD19/Cy5FC,IF
    orb915599Anti-alpha  smooth muscle Actin/PE-Cy3FC
    orb917495Anti-F-Actin/PE-Cy7FC
    orb917499Anti-RAGE/PE-Cy7FC
    orb917649Anti-GLUT1/PE-Cy5.5FC
    orb941999Anti-NeuN/PE-Cy7ICC,FC
    orb959894Anti-GFAP/PE-Cy5.5ICC,FC
    orb959955Anti-NFKB  p65(acetyl-K310)/PE-Cy5FC
    orb967450Phospho-Smad2  (Ser250)/PE-Cy5.5FC
    orb967820Anti-VWF/PE-Cy7FC
    orb967825Anti-Synaptopodin/PE-Cy7FC
    orb973383Anti-PXR/PE-Cy5FC
    orb979674Anti-ZNF683/Cy3FC
    orb982588Anti-Sca1/Cy3FC,IF
    orb991834Anti-SP-C/APCFC
    orb993436Anti-Bone  Alkaline Phosphatase/APCFC,IF
    orb993553Anti-CD16/APCFC,IF
    orb993611Anti-Calreticulin/APCFC,IF
    orb994742Anti-SREBP2/APCICC,FC,IF
    orb994938Anti-Dopamine  D5 receptor/APCFC,IF
    orb995017Anti-Claudin  1/APCFC
    orb995082Anti-CXCL10/IP10/APCFC,IF
    orb995560Anti-CD20/APCFC
    orb998027Anti-CD44v3/APCICC,FC,IF
    orb1000842Anti-Phospho-MYPT1(Thr696)/APCICC,FC,IF
    orb1001893Anti-VNN1/APCICC,FC,IF
    orb1004685Anti-FCGRT/APCICC,FC,IF
    orb1005088Anti-Fragilis/APCICC,FC,IF
    orb1005524Anti-Cytokeratin  4/APCFC,IF
    orb1005708Anti-Nogo-A/APCFC,IF
    orb1005735Anti-PDGFRA/APCFC,IF
    orb1005736Anti-PDGF-B/APCFC,IF
    orb1005799Anti-TGF  beta Receptor I/APCFC,IF
    orb1006424Anti-EGFRvIII/APCICC,FC,IF
    orb1006496Anti-CLEC2D/APCFC,IF
    orb1007330Anti-Phospho-mTOR  (Thr2446) /APCFC,IF
    orb1007509Anti-SOX9/APCFC,IF
    orb1007931Anti-CKAP4/APCFC,IF
    orb1009483Anti-PAX6/APCICC,FC,IF
    orb1009572Anti-TPOR/APCFC
    orb1046500Anti-Amphiregulin/Cy5.5FC
    orb1048324Anti-Phospho-Histone  H2A.X (Ser139)/Cy7ICC,FC,IF
    orb1063819EP4  antibodyFC,WB
    orb1572137Phospho-HSD17B13  (Ser33) AntibodyICC,FC,WB
    orb1577230VEGFR3  Antibody (Cy5)ICC,FC
    orb1583206E  cadherin Antibody (PerCP)ICC,FC
    orb1584383RUNX1  Antibody (BF555)FC
    orb1588962ganglioside  GM1 Antibody (PerCP)FC
    orb158995514-3-3  Antibody (BF750)FC
    orb158995614-3-3  Antibody (BF680)FC
    orb158995714-3-3  Antibody (BF647)FC
    orb158995814-3-3  Antibody (BF594)FC
    orb158995914-3-3  Antibody (BF555)FC
    orb158996014-3-3  Antibody (BF488)FC
    orb158996114-3-3  Antibody (BF405)FC
    orb158996214-3-3  Antibody (BF350)FC
    orb158996314-3-3  Antibody (Cy7)FC
    orb158996414-3-3  Antibody (Cy5.5)FC
    orb158996514-3-3  Antibody (PerCP)FC
    orb158996614-3-3  Antibody (Cy7)FC
    orb158996814-3-3  Antibody (Cy5)FC
    orb1592229Phospho-GCN2  (Thr899) Antibody (Cy5)FC
    orb1594135GLUT1  Antibody (BF555)FC,IF
    orb1594414Annexin  V Antibody (Cy5.5)FC
    orb1595292LPAP  Antibody (PerCP)FC
    orb1598709Tap1  Antibody (BF405)FC,IF
    orb1600370VEGFA  Antibody (BF488)FC,IF
    orb1600770IL-15  Antibody (BF405)ICC,FC,IF
    orb1600788CREM  Antibody (PerCP)ICC,FC
    orb1601401PIEZO1  Antibody (BF488)ICC,FC,IF
    orb1602128Melatonin  Receptor 1A Antibody (Cy7)FC
    orb1603027PODXL  Antibody (BF555)FC,IF
    orb1606712phospho-IKK  beta (Tyr188) Antibody (Cy5)FC
    orb1608014TGF  beta Receptor I Antibody (PerCP)FC
    orb1609870Geminin  Antibody (APC/Cy5)FC
    orb18160923326-32-7  Antibody (FITC)FC

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    发表于 2024-10-20 12:09 | 显示全部楼层
    喜讯！易基因表观转录组学RNA-BS技术服务见刊《核酸研究》
    大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。
    2024年2月15日，吉林大学张涛、赵飞宇、李金泽为共同第一作者，吉林大学李占军、隋婷婷及赖良学为共同通讯在《Nucleic Acids Research》（NAR/ IF14.9）发表题为“Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase”的研究论文，通过m5C RNA-BS等分析揭示RCMS（reengineered m5C modification system）编辑系统能够精确地在特定RNA位点掺入或去除m5C修饰，改变细胞转录本的稳定性。此外，RCMS编辑系统还调控tRNA m5C水平，影响细胞的转录本丰度、细胞增殖和迁移能力。


    标题：Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase（通过dCasRx偶联的甲基转移酶和去甲基化酶实现细胞RNA的可编程m5C修饰）
    时间：2024.2.15
    期刊：Nucleic Acids Research（核酸研究）
    影响因子：IF 14.9
    实验方法：RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、mRNA BS-seq、免疫荧光显微镜和RNA衰变实验等（易基因科技为本研究提供mRNA BS-seq建库测序分析技术服务）


    研究摘要：

    5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种丰富的RNA修饰，在调控RNA命运和基因表达中起着至关重要的作用。尽管最近在理解m5C的生物学作用方面取得了进展，但无法在转录本中的特异性位点引入m5C阻碍了揭示特异性m5C与表型结果之间直接联系的研究。本研究作者开发了一种基于CRISPR-Cas13d的编辑系统，名为重编程m5C修饰系统（reengineered m5C modification system，简称RCMS），用于特定转录本中的靶向m5C甲基化和去甲基化。RCMS编辑系统由核定位的dCasRx与甲基转移酶（NSUN2/NSUN6）或去甲基化酶（小鼠Tet2的催化结构域）（ten-eleven translocation 2，TET-2）结合而成，可以在精确m5C位点操纵甲基化事件。研究揭示了RCMS编辑系统可以诱导特异性m5C甲基化和去甲基化。此外研究还证实了RCMS编辑系统在调控转运RNA m5C水平以及通过m5C介导的机制诱导转录本丰度和细胞增殖变化的能力。研究结果共同将RCMS编辑系统确立为一种靶向表观转录组编辑工具，有助于鉴定单基因m5C变化及其可能产生结果。对于深入理解RNA修饰在生物学过程中的作用以及开发新的治疗策略具有重要意义。



    图形摘要

    研究结果：

    （1）可编程m5C编辑系统设计


    • NSUN6酶验证可编程位点特异性m5C writer活性


    图1：NSUN6在HEK293T细胞中验证可编程位点特异性m5C writer活性。

    • 将NSUN6甲基转移酶与dCasRx结合以构建RCMS-dCasRx-NSUN6编辑器。
    • RCMS策略。该策略涉及使用与NSUN6甲基转移酶结合的可编程RNA结合蛋白，如dCasRx，通过靶转录本中特定gRNA方式，诱导从C到m5C的位点特异性甲基化。
    • RPSA mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。
    • 通过RT-qPCR使用CasRx评估RPSA gRNA的靶向效率（n=3）。
    • 使用HiTOM深度序列分析评估RCMS dCasRx-NSUN6编辑器靶向m5C甲基化后RPSA m5C位点的m5C比率水平（n=3）。
    • 在HEK293T细胞中，使用与非靶向gRNA或RPSA gRNA结合的dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6评估RPSA mRNA水平（n=3）。
    • 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA分析HEK293T细胞中RPSA的蛋白水平。
    • 在用10 mg/ml放线菌素D（一种有效的转录抑制剂）处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR检查指定时间点的RPSA水平（n = 3）。
    “非靶向gRNA”被用作非靶向对照。误差线表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示双尾不成对双样本t检验不显著。

    • dCasRx-NSUN2在人类细胞中对内源性转录本的甲基化


    图2：dCasRx-NSUN2在人类细胞中对内源性转录本的甲基化。

    • 将NSUN2甲基转移酶分别与dCasRx结合以生成RCMS dCasRx-NSUN2编辑器。
    • 提出带有NSUN2的dCasRx RCMSs策略。
    • 展示KAT7 mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。
    • RT-qPCR检测KAT7 gRNA使用CasRx的靶向效率（n=3）。
    • 通过RCMS dCasRx-NSUN2编辑器对靶向m5C甲基化后KAT7 m5C位点的C-to-T突变率进行定量，每个条形图上方显示总测试数[dCasRx-Tet2 CD+非靶向gRNA（6/17），dCasRx-Tet2 CD+KAT7 gRNA（15/29），dCasRx-Tet2 CD+KAT7 gRNA（10/29）；n1/n2，n1表示胞嘧啶数量，n2表示总测试数。
    • HEK293T细胞中，使用与非靶向gRNA或KAT7 gRNA结合的dCasRx-NSUN2分析KAT7 mRNA水平（n=3）。
    • 用dCasRx-NSUN2或dCasRx-dNSUN2联合非靶向gRNA或KAT7 gRNA评估HEK293T细胞中KAT7的蛋白水平。
    • 在用10 mg/ml放线菌素D（一种强效的转录抑制剂）处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR分析指定时间点的KAT7 mRNA水平（n = 3）。
    “非靶向gRNA”用于非靶向。误差线表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示双尾不成对双样本t检验（n=3）不显著。

    • 通过Tet2验证可编程位点特异性m5C eraser活力


    图3：通过RCMS eraser dCasRx-Tet2 CD进行mRNA转录本的靶向去甲基化。

    • 将Tet2 CD（Tet2催化域）分别与dCasRx结合以生成RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器。
    • 提出带有Tet2 CD的dCasRx RCMSs策略。
    • TRAF7（肿瘤坏死因子TNF受体相关因子7）mRNA m5C位点和gRNA靶向区域示意图。
    • 通过RT-qPCR检测TRAF7 gRNA的CasRx靶向效率（n=3）。
    • 通过RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器靶向m5C甲基化后，对TRAF7 m5C位点的C-T突变比率进行定量检测，测试数字显示在每个条形图上方。dCasRx-Tet2 CD+非靶向gRNA（13/21），dCasRx-Tet2 CD+TRAF7 gRNA（10/19），dCasRx-Tet2 CD+TRAF7 gRNA（12/19）；n1/n2，n1表示胞嘧啶数量，n2表示总检测数。
    • 使用与TRAF7 gRNA或非靶向gRNA结合的dCasRx-Tet2 CD分析TRAF7 mRNA水平（n = 3）。
    • 用dCasRx-Tet2 CD联合TRAF7 gRNA或非靶向gRNA检测HEK293T细胞中TRAF7的蛋白水平。
    • 在用10 mg/ml放线菌素D处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR检测指定时间点的TRAF7 mRNA水平（n = 3）。
    • BBS4 （Bardet-Biedl综合征4）mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。
    • 使用RT-qPCR检测BBS4 gRNA使用CasRx的靶向效率（n = 3）。
    • 使用HiTOM分析深度序列对dCasRx-Tet2CD编辑器靶向m5C甲基化后BBS4 m5C位点的m5C比率定量检测（n = 3）
    • 在HEK293T细胞中，使用与BBS4 gRNA或非靶向gRNA结合的dCasRx-Tet2CD分析BBS4 mRNA水平（n = 3）。
    • 用dCasRx-Tet2CD联合BBS4 gRNA或非靶向gRNA评估HEK293T细胞中BBS4的蛋白水平。
    • RT-qPCR检测10 mg/ml放线菌素D处理的HEK293T细胞在指定时间点的BBS4 mRNA水平（n=3）。
    （2）RCMS在tRNA中诱导可编程位点特异性m5C水平



    图4：HEK293T细胞中靶向处理tRNA转录本甲基化和去甲基化。

    • NSUN2-/-细胞系构建示意图。首先用编码BE4max编辑器和靶向NSUN2基因的gRNA的质粒转染HEK293T细胞。转染后，将细胞稀释并接种到96孔板中进行克隆选择，并筛选单克隆细胞的所需NSUN2-/-基因型。
    • Gln11中NSUN2-/-细胞系的Sanger测序色谱图。
    • NSUN2-/-细胞系中NSUN2 mRNA水平（n = 3）。
    • WT细胞和NSUN2-/-细胞中NSUN2蛋白表达的Western blot结果。
    • 人tRNAVal示意图，tRNAVal中三个m5C位点用红色箭头标记。
    • tRNAVal中gRNA位点示意图。
    G-I.  使用dCasRx-NSUN2编辑器在NSUN2-/-细胞系中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNAVal的m5C38、m5C48和m5C49位点的m5C比率（n=3）。
    J-L.  使用dCasRx-Tet2 CD编辑器在HEK293T细胞中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNAVal的m5C38、m5C48和m5C49位点的m5C比率（n=3）。
    M. 人类tRNA Lys的示意图，tRNA Lys中的m5C48位点用红色箭头标记。
    N. tRNA Lys中gRNA位置示意图。
    O. 使用dCasRx-Tet2 CD编辑器在HEK293T细胞中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNA Lys的m5C48位点m5C比率（n=3）。
    （3）RCMS编辑器在人类细胞中的非靶向甲基化（Off-target methylation）



    图5：RCMS dCasRx-NSUN6编辑器的特异性和非靶向甲基化。

    • 通过RCMS dCasRx-NSUN6编辑器靶向RPSA的m5C甲基化后，m5C富集转录本的mRNA水平（n = 3）。
    • 通过RCMS dCasRx-NSUN2编辑器靶向KAT7的m5C去甲基化后，m5C富集转录本的mRNA水平（n = 3）。
    • 用RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器靶向BBS4的m5C去甲基化后，m5C富集转录本的mRNA水平（n = 3）。
    • 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-NSUN6和RPSA靶向gRNA或非靶向gRNA转导的HEK293T细胞中m5C甲基化位点的差异富集。顶部代表上述条件下m5C位点的差异甲基化，表明差异甲基化位点具有统计学意义（P＜0.05）。底部代表维恩图，描绘了用于上述比较的所有甲基化m5C位点的重叠。用三个独立的生物学重复进行BS-seq分析。非靶向gRNA用于非靶向。误差线表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示双向方差分析和Dunnett多重比较不显著。
    （4）HepG2细胞中使用RCMS进行可编程RNA m5C修饰



    图6：RCMS dCasRx-NSUN6编辑器对HepG2细胞中的RPSA m5C位点进行修饰。

    • 深度序列HiTOM分析在RCMS dCasRx-NSUN6编辑器和RPSA gRNA-150 nt靶向下RPSA m5C234位点的m5C比率（n=3）。
    • dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt转导的HEK293T细胞RPSA的mRNA水平（n = 3）。
    • 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt转导的HEK293T细胞中RPSA的蛋白质水平。
    • 通过RT-qPCR在指定的时间点检测经10 mg/ml放线菌素D处理的HEK293T细胞中RPSA水平（n=3）。
    • CCK8法检测dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6和非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt转导的HepG2细胞增殖（n=6） 。
    • 使用dCasRx-NSUN6和RPSA gRNA-150 nt对RPSA进行靶向甲基化的HepG2细胞的划痕实验的代表性图像。在初始划痕后0h和36h记录划痕测量值。比例尺：200微米。
    • 伤口愈合试验的统计分析（n=3）。


    图7：RCMS dCasRx-NSUN6编辑器对HepG2细胞中的RPSA m5C位点进行修饰。

    • 利用深度序列HiTOM分析RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器和RPSA gRNA 0 nt靶向下RPSA m5C234位点的m5C比率（n=3） 。
    • dCasRx-Tet2 CD或dCas-dTet2 CD联合非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt转导的HEK293T细胞RPSA的mRNA水平（n = 3）。
    • dCasRx-Tet2 CD或dCasRx-dTet2 CD联合非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt转导的HepG2细胞RPSA的蛋白水平。
    • RT-qPCR在指定时间点检测经10 mg/ml放线菌素D处理的HepG2细胞中RPSA水平（n=3）。
    • CCK8法检测转染dCasRx-Tet2 CD或dCasRx-dTet2 CD和非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt的HepG2细胞增殖（n=6）。
    • dCasRx-Tet2 CD和RPSA gRNA 0 nt对RPSA进行靶向甲基化的HepG2细胞中伤口愈合实验的代表性图像。在初始划痕后0和36小时记录划痕测量。比例尺：200微米。
    • 伤口愈合实验的统计分析。
    研究小结

    本研究标志着RCMS作为一种靶向表观转录组编辑工具的开创性建立，并探讨了其潜在应用。研究揭示了RCMS的广泛功能，允许在跨RNA靶标中进行精确的位点特异性m5C掺入或去除。这以甲基化依赖性方式改变了细胞转录本稳定性。研究新开发的RCMS具有特异性潜能可以阐明m5C与表型之间的功能关系，并推进m5C生物学的基础研究。
    关于易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术

    m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。
    易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：

    • 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
      mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。
    • 常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：
    易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。


    技术优势：

    • 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
    • 高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
    • 单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
    • 高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。
    研究方向：

    • 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
    • 此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
    实验策略：



    易基因RNA m5C甲基化建库测序示意图

    易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。


    参考文献：

    Zhang T, Zhao F, Li J, Sun X, Zhang X, Wang H, Fan P, Lai L, Li Z, Sui T. Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase. Nucleic Acids Res. 2024 Feb 15. pii: 7608824. doi: 10.1093/nar/gkae110. PubMed PMID: 38366553.
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    继续前进
    发表于 2024-10-20 12:10 | 显示全部楼层
    流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术，它可以对液流中的单细胞进行快速、准确的定性和定量分析。在流式细胞仪中，样品被引入细胞通道，单个细胞通过激光束时，激光与细胞相互作用，产生多个散射光和荧光信号，这些信号被收集并转换为电信号，然后通过电子学系统进行放大、处理和分析。
    通过使用不同的荧光染料或荧光标记抗体，可以对细胞表面标记物、细胞内容物、细胞活性等多个参数进行测量，这使得研究人员能够确定不同类型的细胞、细胞亚群或细胞状态。流式细胞分选已被广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学等领域，随着单细胞测序技术的发展，以及研究维度的精细化需求，流式分选与单细胞测序的结合也将愈发紧密。
    我们将流式分选方法简单分为特异性直标抗体分选和自发荧光分选两种，它们在目标细胞标记和分选原理上有所不同。
    特异性直标抗体分选

    原理：选择与目标抗原特异性结合的直标荧光抗体，将待分选的细胞样品与荧光标记抗体一起孵育，使抗体与细胞表面抗原特异性结合，通过流式细胞仪检测相应的荧光信号来识别和分选。

    • 特异性直标抗体分选案例：小鼠-心脏-CD45分选


    自发荧光分选

    原理：通过基因工程技术使样本目的基因上融合荧光蛋白基因，如GFP/RFP基因等，流式细胞仪通过检测细胞内自发产生的荧光信号来识别和分选，这种方法适用于那些已经被转基因表达荧光蛋白的细胞或组织。

    • 自发荧光分选案例：阳性细胞
    如果实验目的在于研究没有特异性细胞表面标志物的细胞类型，通过自发荧光分选得到目的细胞，进行后续单细胞测序，比如分选得到血液中自发荧光阳性细胞、肺组织中的自发荧光阳性细胞，则可以通过常规胞质内的荧光蛋白表达，实现阳性细胞的分选。
    01 样本类型——分群明显


    空白组为野生型小鼠，未做特殊处理，明确不带荧光；实验组为GFP组，带自发荧光；流式分析可见明显分群。
    02 样本类型——分群不明显


    此类流式样本存在一定比例的假阳性、假阴性，需要科研人员对于实验熟悉程度高，可指导实验人员共同进行圈门操作。
    03 样本类型——荧光丢失型
    实验组和空白对照组的荧光强度几乎无差别，实验组发生了荧光淬灭等现象。

    • 自发荧光分选案例：阳性细胞核
    如果实验目的在于研究酶解较难得到且特殊关注的细胞类型，通过组织抽核后分选荧光蛋白阳性的细胞核，用于后续单细胞测序，比如脑、脊髓等神经元细胞的自发荧光阳性细胞，植物特殊细胞类型等，这种情况建议基因编辑时荧光蛋白带核定位信息，即荧光蛋白在核内存在，从而实现阳性细胞核的分选。
    01 文献案例——小鼠肠道神经元细胞核


    参考文献：Obata Y, Castaño Á, Fallesen TL, Bon-Frauches AC, Boeing S, Huseynova A, McCallum S, Lasrado R, Heanue TA, Pachnis V. Molecular profiling of enteric nervous system cell lineages. Nat Protoc. 2022 Aug;17(8):1789-1817. doi: 10.1038/s41596-022-00697-4. Epub 2022 Jun 8. PMID: 35676375.
    02 文献案例——小鼠脑神经元细胞核


    参考文献：Okada S, Saiwai H, Kumamaru H, Kubota K, Harada A, Yamaguchi M, Iwamoto Y, Ohkawa Y. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. J Cell Physiol. 2011 Feb;226(2):552-8. doi: 10.1002/jcp.22365. PMID: 20717962.
    03 文献案例——植物特殊细胞类型细胞核


    参考文献：Weinhofer I, Köhler C. Endosperm-specific chromatin profiling by fluorescence-activated nuclei sorting and ChIP-on-chip. Methods Mol Biol. 2014;1112:105-15. doi: 10.1007/978-1-62703-773-0_7. PMID: 24478010.
    自发荧光分选-单细胞实验总结



    注:自发荧光分选风险性较高，请谨慎选择

    截至目前，诺禾致源单细胞业务部CytoFLEX SRT流式分选平台已累积荧光分选经验1000+例，助力客户样本纯化600+例，包括人、小鼠、猴、猪、羊等物种，心、肝、脑、肺、肾、小肠、肌肉、胰腺、脾、外周血、骨髓血等多种组织类型，助力客户在单细胞测序研究中精细化目的细胞群的实验需求。
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    大力水手
    发表于 2024-10-20 12:11 | 显示全部楼层
    1、流式细胞术的基本原理

    流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用来分析并测量单个细胞特征的技术。流式细胞仪的工作原理是将经过标记处理的细胞样本在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态和表面标记物等信息。最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
    流式细胞仪利用标记物的荧光信号来识别和分析细胞的特征，不仅能够帮助研究人员了解细胞表型和功能，还广泛应用于临床诊断、药物筛选和疾病研究中。
    2、流式细胞术的特点

    赛多利斯iQue® 3采用先进的流式细胞术平台，专注于加快整体工作流程，具有以下特点。


    l 快速：在整个实验过程中采用快速的平板取样、综合分析和新型数据约减工具来突破容量瓶颈，5分钟即可完成一块96孔板的检测与分析。
    l 微量化：通过从微量样本中采样，最少只需一微升 , 节约珍贵的样本和试剂。
    l 高内涵：同时测量同个孔中的表型和细胞因子，可生成更多生物相关数据。
    l 易用性：利用可易于实现的自动化功能，可打造简单、可扩展的多用户环境，包括 48 小时不间断运行和自动化板载QC微球振荡；工作流程导向的软件界面，试剂盒自带采集和分析模板​。
    l 洞察力：利用新颖的可视化工具可显著缩短决策时间，即使是从复杂的数据集中也可以在短时间内获得可操作结果，可整板显示直方图、散点图和叠加的直方、散点图，自动计算IC50/EC50。
    3、 应用

    （1）细胞健康和增殖分析

    增殖、细胞凋亡和细胞毒性是细胞健康的重要衡量指标，能够研究药物、培养条件和基因改造对细胞生长或活力的影响。

    • 细胞计数
    流式细胞术的研究早已不仅局限于定性检测，更注重定量分析，通过加入荧光参比微球使得流式细胞仪获得细胞绝对计数的结果。
    iQue® 细胞计数和活力分析试剂盒可在 96 孔和 384 孔板中在宽线性范围内获得高准确度，对来自各种非贴壁细胞系的绝对细胞计数和活力数据进行可重现的分析。该试剂盒可识别活细胞，免清洗步骤，并且包括经过验证的预设分析模板，可结合iQue®流式细胞仪快速筛选和分析。



    图1. 对各种比率的生长细胞与热灭活细胞（Jurkat、Raji 或 Ramos 细胞系）的混合物进行测试，以确保整个灵敏度范围内的线性相关性。



    图2. 模板化圈门和分析


    • 细胞活力
    当通过流式细胞术进行细胞分型时，将死细胞排除在最终数据分析之外，确定细胞活力十分重要。目前有许多固定活力染色法可用于量化细胞活力，但是这些方法与固定方案不兼容，最终可能导致在数据集中出现伪影。
    iQue® 可固定活力染料是一种区分活细胞和死细胞的氨基活性不透膜染料。染色的细胞可以固定和透化，使染料与下游细胞内染色相容，并且强度不会有任何减弱。iQue® 可固定活力分析试剂盒有三种不同颜色可供选择，可以满足流式多色 Panel 的需求。



    图3. iQue® 可固定活力染料染色的 PBMC 的细胞内 IFN-γ 表达检测和分析实例。


    • 细胞凋亡
    细胞凋亡是正常组织发育和内稳态的重要过程，细胞通过该过程适时发生程序性细胞死亡。在大多数情况下，细胞凋亡的诱导导致线粒体去极化、Caspase 激活和质膜改变。同时检测多种细胞凋亡标志物能够确认细胞凋亡途径并深入了解随时间变化的作用机制。



    图4. 细胞凋亡标志物：1) 线粒体去极化，2) Caspase 3/7，3) Annexin V，4) 死亡。

    iQue® 人四重细胞凋亡分析试剂盒不仅可以在单个样品中同时检测 Caspase 3/7 活化、Annexin V 结合、细胞活性和线粒体去极化（图 21），还可计算细胞总数，以识别剧毒的药物。根据实验目的，四种试剂可以同时使用（图5(A) 和图5(B)），也可以相互组合使用，无需清洗。细胞凋亡试剂也可以与其他 iQue® 试剂联合使用实现多重分析。



    图5. 当用诱导细胞凋亡的药物处理时，细胞健康标志物表现出时间依赖性增加。

    将 Jurkat 细胞 (1e6 个细胞/mL) 用各种浓度的星形孢菌素进行处理。在使用 3 种细胞凋亡试剂处理 2 h、6 h 和 24 h 后，取 20 µL 样品进行分析。(A) 在 2 h 时半胱天冬酶阳性细胞百分比 (%) 的热图，(B) 线粒体去极化，(C) Caspase，(D) Annexin V。
    （2）免疫细胞功能分析

    免疫细胞根据其周围环境具有不同而复杂的反应和功能。根据这些混合表型的细胞表面标记表达和/或分泌的可溶性介质来鉴定免疫细胞对于发现新治疗方法至关重要。

    • T细胞活化
    抗原和共刺激信号对初始T细胞的活化启动了CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的克隆扩增。T细胞活化分析的监测和定量能够帮助我们更好地理解T细胞如何对某些刺激作出响应。



    图6. iQue®人T细胞活化分析试剂盒的分析原理示意图。

    不同T细胞表型分析主要通过检测3个活化标志物的表达：CD69（早期）、CD25（晚期）和 HLA-DR（更晚期）。还可以使用2-plex Qbeads，通过夹心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 种效应细胞因子（IFNγ 和 TNFα）。



    图7. 通过T细胞活化分析试剂盒进行T细胞表型和细胞因子释放分析。


    • T细胞杀伤
    细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)是免疫系统的功能性 (CD8+) 细胞亚群，可释放穿孔素，在靶细胞膜上形成孔洞，颗粒酶通过这些孔洞进入细胞，诱导靶细胞凋亡。



    图8. iQue® 人 T 细胞杀伤分析试剂盒的分析原理示意图。

    通过 CD8+ T 细胞的状态分析，可检测活化标志物 CD25 和耗竭标志物 PD-1，还可以使用 2-plex Qbeads，通过夹心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 种效应细胞因子（IFNγ 和颗粒酶 B）。



    图9. 通过 iQue® 人 T 细胞杀伤分析试剂盒进行 T 细胞表型和细胞因子释放分析。


    • NK细胞杀伤
    评估NK细胞介导新疗法的关键过程之一是定量分析NK细胞活化和肿瘤杀伤能力，以深入洞察潜在的疗效。



    图10. iQue® 人NK细胞杀伤分析试剂盒的分析原理图解。

    iQue® 能够在一个孔中同时进行靶细胞识别、细胞健康、细胞功能、免疫分型和细胞因子分析。靶细胞通过荧光编码染料染色与效应细胞区分开来，然后通过荧光细胞膜完整性染料进行染色，检测肿瘤细胞杀伤效果。使用 CD3、CD56 和 CD16 识别 NK 细胞，使用 CD69 和 CD25 评估细胞的活化状态。在同一孔中，使用 2种 iQue® Qbeads®，通过夹心法免疫分析对促炎细胞因子干扰素 γ (IFNγ) 和促凋亡丝氨酸蛋白酶 - 颗粒酶 B 的产生进行定量分析。还可以使用人 NK 细胞配套试剂盒分析其他细胞因子。搭配iQue® 人NK 细胞配套试剂盒，还可以检测6 种额外的人细胞因子和效应蛋白。



    • T细胞记忆
    疫苗和过继性细胞转化免疫治疗方案都会受记忆T细胞异质性的影响，能够使用单个方法鉴别这些功能不同的记忆T细胞亚群对于免疫治疗具有重要意义。



    图11. iQue® 人T细胞记忆分析试剂盒的分析原理示意图。在单个孔中同时测量活化标志、细胞增殖和细胞因子。

    通过 CD3、CD4 和 CD8 标志物的染色检测 T 细胞的基本表型。通过 CD45RA、CD45RO、CD27、CD62L 和 CD95 标志物的染色检测 T 细胞活化后不同分化阶段的 T 细胞亚型（TN、TSCM、TCM、TTM、TEM、TEMRA 和 TTE）。在同一个孔中，还可以通过夹心法免疫分析，使用 Qbeads 定量分泌的促炎细胞因子 IFNγ 和抗炎细胞因子 IL-10。使用膜完整性荧光染料进行染色，区分活免疫细胞与死细胞。

    • T细胞耗竭
    T细胞耗竭是指长期刺激造成的 T 细胞功能障碍。耗竭性t细胞可表现出独特的表型，包括抑制性标志物（例如 PD-1、LAG-3 和 TIM-3）过度表达，以及 T 细胞释放促炎性细胞因子（IFNγ 和 TNFα）的能力减弱。



    图12. iQue® 人 T 细胞耗竭分析试剂盒的分析原理示意图。

    T 细胞表型分析主要通过检测 3 个耗竭标志物的表达：PD-1（早期）、LAG-3（中期）和 TIM-3（晚期）。还可以使用 2-plex Qbeads，通过夹心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 种效应细胞因子（IFNg 和 TNFα）。

    • TIL和MLR
    以温和方式分离 3D 肿瘤模型，从而对 T 细胞浸润进行定量分析：



    图13. 使用 iQue® 高通量流式细胞仪平台对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）进行体外分析的方案示意图。

    MLR通过将来自两个个体的免疫细胞进行共培养，以触发免疫检查点调控所需的“非自体”识别：



    图14. 混合淋巴细胞反应 (MLR) 的分析原理示意图

    对T细胞表型和功能的全面评估对于理解T 细胞生物学和建立更好的治疗方法至关重要。iQue®高通量流式细胞仪搭配基于免疫细胞和微球的试剂盒为免疫细胞功能表征提供全新解决方案。智能Forecyt®软件自动生成直方图、剂量反应曲线以及整板可视化数据结果，简化流式分析，提供更多见解。


    （3）抗体表征


    • 抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP)
    抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP) 是一种免疫消除机制，其凭借单克隆抗体 (mAb) 靶向肿瘤细胞，以促进吞噬免疫细胞将肿瘤细胞从体内清除。
    iQue® 的 ADCP 利用 iQue® 人抗体依赖性细胞吞噬作用试剂盒，通过精简的工作流程对活靶细胞与 CD14+ 原代效应细胞的共定位进行定量，实现 ADCP 的高通量测定。



    图15. iQue® 人抗体依赖性细胞吞噬作用试剂盒分析原理示意图。

    在 96 孔板或 384 孔板中，将 iQue® 增殖和编码（B/绿色）染料标记的靶细胞与测试抗体共孵育，然后加入未标记的效应细胞（PBMC 或富集的单核细胞或巨噬细胞群）。
    使用 iQue® 细胞膜完整性（R/红色）染料分离活细胞与死细胞。将根据靶细胞编码器呈阳性的活的 CD14+ 效应细胞的百分比对 ADCP 进行定量。



    图16. 简便的 iQue® 人抗体依赖性细胞吞噬作用试剂盒实验方案。


    • 抗体内化
    细胞表面抗原特异性的抗体会诱导内吞作用，从而导致这些抗体以及与其结合的任何分子一起被细胞内化，这一过程被称为抗体内化（ABI），在研究和临床发现方面具有许多强大的应用。



    图17. pH 敏感荧光探针原理。

    iQue®抗体内化试剂盒提供一种新型 pH 敏感荧光探针能够在完整的含血清培养基中快速、无需洗涤地标记同种型匹配的抗体。当内化抗体被加工到酸性内体和溶酶体途径时，会产生荧光信号。抗体内化被量化为荧光探针呈阳性的活细胞的百分比。使用随附的 iQue ®细胞膜完整性染料可以同时测量细胞活力。



    图18. iQue®抗体内化试剂盒示意图。


    • 抗体结合分析
    iQue®抗体结合测定和工作流程可以帮助识别和表征抗体与靶点的结合。我们提供两种检测方法：第一种是直接抗体结合测定，可以根据与靶细胞的结合对 mAb 进行排序，并能够在单个孔中分析与多种细胞类型的结合。第二种是竞争性结合测定，可以揭示针对不同表位的单克隆抗体。



    图19. 直接抗体结合测定工作流程。



    图20. 竞争抗体结合测定工作流程。


    • 补体依赖细胞毒性分析
    抗体疗法的三个关键 Fc 介导功能是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP) 和补体依赖性细胞毒性 (CDC)。在 单克隆抗体（mAb） 开发过程中，必须分析新型 mAb 候选物的 CDC 活性，以全面了解其 Fc 介导的抗肿瘤功能。



    图21. 使用高通量流式细胞术进行 CDC 测定的工作流程示意图。

    我们提出了一种简单、简化的检测方法，使用 iQue®高级流式细胞术平台测量单克隆抗体针对活靶细胞的 CDC 活性。在人血清存在的情况下用感兴趣的单克隆抗体培养靶细胞，其中含有启动补体级联以及随后在细胞上形成膜攻击复合物所需的蛋白质。使用 iQue®细胞膜完整性（R/红色）染料标记细胞，以定量细胞死亡作为 CDC 活性的指标。
    （4）基于微球的多细胞因子分析

    生物学相关分泌蛋白和细胞因子的定量在基础研究和药物开发中至关重要，对于理解炎症和肿瘤学中的 T 细胞活化和细胞信号级联放大作用等都有极大帮助。
    借助丰富的 iQue® Qbeads® Plexscreen 的系列试剂，研究人员可通过不同类型的微球捕获来分析分泌蛋白，从而实现生物参数的多重定量。用户可以将 iQue® Qbeads® 检测与其他 iQue® 分析试剂盒结合使用，通过简化的无缝工作流程，对蛋白质分泌、细胞活力、标志物表达和增殖进行高通量测量。



    图22. 使用 iQue® Forecyt® 软件系统快速方便地分析数据。



    图23. 分泌信号分子和细胞功能的多重定量。

    （5）其他


    • iPSC诱导多能干细胞分析
    2020年时，阿斯利康改良Crisper-cas9技术，开发了一种ObLiGaRe强力霉素诱导型SpCas9(ODInCas9)转基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe导致人类或小鼠细胞的功能整合，最终产生ODInCas9小鼠，并且验证发现这种小鼠体细胞体内编辑可以模拟非小细胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治疗研究能够验证候选药物的功效。在判断基因编辑成功与否时，应用到Incucyte® 检测细胞增殖，并联合使用iQue® 及Incucyte® 筛选GFP阳性的细胞。



    图24. 高通量筛选编辑成功的GFP阳性细胞。

    将各种不同组织细胞以及iPSC细胞导入OdInCas9，抗生素筛选后进行单克隆挑选培养，用Incucyte® 拍照成像，识别GFP阳性细胞，为确定是否真正导入OdInCas9，加入Dox诱导GFP表达，细胞消化后放入96孔板，用我们的iQue® 鉴别GFP阳性细胞。
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    卡卡
    发表于 2024-10-20 12:11 | 显示全部楼层
    流式细胞术的9大应用

    1.细胞表型检测

    免疫细胞表型是流式细胞术最突出应用。
    通过检测免疫细胞群的表面或细胞内标志物，对其进行鉴定和表征。流式细胞术能够精确鉴定和分类免疫细胞群，例如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板和粒细胞等。
    研究人员可以识别和量化异质群体中的各种免疫细胞亚群。
    临床医生可以诊断和监测各种血液系统疾病、进行免疫免疫评估（8大类免疫细胞构成与肿瘤预后）。
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    2.细胞活力检测

    流式细胞术能够定量测量群体内和体外培养的活细胞和非活细胞。
    通过使用选择性标记活细胞或死细胞的荧光染料，流式细胞术可以提供精确可靠的活力测定，有助于确定细胞活力百分比。
    流式细胞术可以根据特定的标志物或染料区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，从而更详细地了解细胞的健康和状态。通过将活力染料与细胞表面抗原、细胞内蛋白或功能测定的标记物相结合，研究人员可以在特定细胞类型或实验条件下获得有关细胞活力及其发生机制的全面信息。
    最常用的活性检测染料
    死细胞：碘化丙啶（ propidium iodide，PI）和7-AAD，与DNA结合，但只能进入膜受损的细胞，使死细胞发出荧光。
    凋亡细胞：annexin V：对磷脂酰丝氨酸具有强结合亲和力的蛋白质，在细胞凋亡的早期阶段暴露在质膜的外表面
    annexin V+PI是常用区分凋亡细胞和坏死细胞的组合。
    活细胞：calcein AM、CFDA（carboxyfluorescein diacetate）、FDA （fluorescein diacetate） ：进入活细胞，但只有在与细胞内酶相互作用时才会发出荧光
    细胞体内增殖：CFSE(CFDA-SE)穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。

    3.细胞周期分析

    从流式细胞术的早期开始，细胞周期分析就成为有价值的应用。
    原理是基于荧光和核酸的量之间的关系。
    常用核酸结合染料：碘化丙啶（PI），Hoechst，DAPI，7-AAD，溴化乙锭等。
    流式细胞术细胞周期分可以有很多方面的应用，例如，DNA/Ki67测定可以将表型选择与细胞周期分析相结合，用于监测p53细胞周期停滞，评估抗癌活，多药耐药性等。

    4.离子通道测定

    钙作为关键的第二信使，在许多细胞信号通路中起着至关重要的作用。它在免疫细胞活化中尤为重要，包括T细胞、B细胞和NK细胞。
    此外，钙信号传导还参与肥大细胞脱颗粒、神经元兴奋性、突触传递和神经递质释放至关重要。
    细胞脱颗粒的早期测量值是通过使用钙离子载体A23187的流式细胞术确定的。
    常用荧光染料：fluo-3 和indo-1。
    虽然Ca2+通道测量是最常见的应用之一，但其他离子如镁、钾、钠和氢也可以使用流式细胞术进行监测。

    5.细胞功能检测

    最早的检测是细胞酯酶。
    使用响应氧化态变化的活性染料检测粒细胞的氧化电位。例如，氢乙啶（hydroethidine）用于中性粒细胞呼吸爆发。
    二乙酸二氯荧光素（dichlorofluorescein diacetate），已被用于吞噬细胞功能研究。
    效应细胞杀伤功能，是流式细胞术的另外一个重要应用。
    细胞因子是免疫细胞功能的重要执行分子，对科学研究，免疫细胞治疗，临床诊疗都及其关键。基于流式细胞术开发的多重细胞因子检测，已经有广泛应用。

    6.蛋白质工程

    流式细胞术和分选传统上不是蛋白质工程中最常用的技术之一。然而，近年来，在该领域的应用越来越多。
    流式细胞术被用于酶学蛋白质研究，包括细胞色素P450、葡萄糖氧化酶、几丁质酶、纤维素酶、过氧化物酶、酯酶、转移酶、β半乳糖苷酶、硫代内酯酶等。
    蛋白质工程，包括在基因水平上引入突变（随机或特异性），以创建由数千到数百万个单个蛋白质变体组成的文库（如上图），使用流式细胞术 每天能够分析多达 10^8–10^9 个克隆，并对具有所需特性的克隆进行分类。

    7.哺乳动物细胞和细菌细胞分选

    细胞分选是流式细胞的重要应用之一，哺乳动物细胞相对成熟，不做赘述。细菌细胞方面的应用，也逐渐开始建立。
    与耗时的传统琼脂铺板检测方法相比，流式分选可以快速检测和分选悬浮液中的单个细菌细胞。
    尽管细胞分选仪具有高性能，但它们在微生物学中的应用一直受到限制。
    这主要是由于微生物体积小，因此很难将它们与培养基中的细胞碎片或背景颗粒区分开来。另一个潜在的问题是，通常没有细菌菌株特有的抗体。
    限制细胞分选仪在细菌检测和分选中的适用性的其他因素主要与分选仪硬件功能本身有关，在流式细胞术仪器的早期，数量有限的激光器和检测器，限制一次只能使用一种或两种荧光染料。随着最新仪器的发展，多激光器和检测起的仪器被开发：包括赛默飞世尔的Bigfoot光谱细胞分选仪，BD FACSAria III分选仪，索尼MA900细胞分选仪和贝克曼库尔特的MoFlo Astrios EQ等。
    此外，部分致病性细菌，需要在BSL2以上的实验环境下进行，现在部分流式细胞术带有BSL 2 hood。

    8.液滴微流体

    液滴微流体是一个相对较新的领域，专注于皮升体积中含有细胞或DNA的离散液滴的形成，操作和分析，应用于生物学、化学、材料科学和医学。
    在生物学中，液滴微流体可实现单细胞分析、生物分子的高通量筛选、细胞异质性研究和药物发现。
    流式细胞术分析是研究单细胞的强大技术，可提供有关各种参数的宝贵信息。然而，它的测量仅限于直接连接到细胞的分子，例如表面或细胞内标记物，限制研究由细胞分泌或由DNA分子产生但不物理附的分子。液滴微流体提供了一种克服这一限制的新方法。将细胞或DNA封装在单个液滴中会产生离散的区室，从而能够分析由封装实体释放或产生的化合物。

    9.下一代生物制剂

    生物制药已经占据了药物市场的重要份额，包括治疗性蛋白质（65%），疫苗（20%）等。通过测序（NGS）进行单B细胞库分析和克隆扩增鉴定，直接从人类幸存者克隆免疫球蛋白基因，分离出高亲和力中和抗体，加快了单克隆抗体药物的研发，然而，这种方法比较昂贵，且依旧需要后续的功能验证等。新策略可使用流式细胞术、MACS或微流体将单细胞分离与功能筛选相结合，降低开发成本并消除失败的候选药物，是流式细胞术新的应用开发方向。

    流式细胞术的实验流程

    一、实验设计

    1、设计多色流式实验时，有两个关键的步骤

    ①了解仪器配置
    了解哪些荧光染料可以使用，哪些不可以使用
    ②了解生物标志物
    列岀感兴趣的标志物，并对其在细胞中的表达丰度和分布有一个总体的了解
    流式细胞仪通常配有多个激光器，它们产生特定波长的光。由于每种荧光染料发出的光通常结合长通或短通滤光片被带通滤光片过滤，故流式细胞仪只检测特定波长范围内的荧光。在选择荧光染料时，请确认仪器带有能够激发目标荧光染料的激光器，以及能够检测该染料发射光的滤光片组合。

    2、抗体选择/多色组合设计

    一般来说，在同一样品上使用的荧光染料越多，从该样品中收集到的信息也越多。在单个样品上组合使用多种荧光染料时，设计需要遵循以下几点基本建议：
    ①<10种颜色
    a.抗原密度*应该与荧光染料亮度相匹配
    最重要的是，低密度或难以检测的标志物应该与明亮的荧光染料配对。
    高密度的标志物与中等或暗淡的荧光染料配对。
    b.选择跨通道的荧光染料，最大限度减少荧光溢漏。
    c.测试！
    ②>10种颜色
    a.让低表达丰度的标志物与明亮的荧光染料相匹配。
    b.最大限度减少溢漏，特别是低表达抗原。
    c.利用溢漏扩散矩阵(SSM)**来确定哪些通道的分辨率可能受到影响。
    d.对于相互排斥的抗原(同一类细胞上不会同时表达的抗原),将次优的荧光染料组合留给它们。
    e.测试！

    注释1：什么是抗原密度？
    抗原密度指的是蛋白质在细胞内或细胞上的表达水平(详见下图)，这是在多色设计时的一个重要考虑因素。为了确保能被检测到，低水平表达的抗原、细胞内抗原或连续表达（非诱导）的抗原应当与最明亮的荧光染料配对。抗原密度和预期表达模式可在网上或文献中查到。




    注释2：溢漏与溢漏扩散之间有何差异？
    溢漏是指荧光染料的信号“溢出”到其他的检测器。这是由荧光染料发射和仪器光学设置产生的问题。如下图所示，绿色信号（AF488）除在FITC滤光片（515-545nm）中检测到。也在邻近的PE滤光片（564-606nm）中检测到。这种溢漏可通过补偿来校正。


    溢漏扩散是因多个荧光染料溢出到每个检测器而导致的测量误差，这引起某些通道的分辨率降低。
    随着实验中荧光染料的数量不断增加，溢漏扩散变得影响更大，并且荧光越亮，扩散越大。通过建立溢漏扩散矩阵（SSM）可识别哪些通道可能出现溢漏扩散的问题。一般来说应避免暗淡信号受到这种现象的影响。
    <hr/>在下图的例子中，2号检测器的荧光扩散到1号检测器，随着2号检测器的信号增强，扩散也增大。因此，如果要分析1号检测器中的低表达抗原（浅灰色圆圈）和2号检测器中的高表达抗原（橙色），低表达抗原的检测会受到影响。


    3、实验对照

    流式细胞术的对照可分为五大类2：
    ①仪器对照
    仪器对照是通过追踪激光器、检测器和流体性能，从而确认仪器是否正常工作3。一般来说，这些对照涉及到仪器制造商提供或出售的校准颗粒或荧光微球。这些质量控制微球应在仪器运行的每一天使用。
    ②补偿对照
    当荧光染料之间的发射光谱重叠时，这些信号会扩散到多个通道。校正溢漏的过程被称为补偿4。补偿可确保检测器只计算该通道特定的荧光发射光（图1）。补偿实验需要每种荧光染料的单染样品（每个样品只染一种染料）。这些可以利用细胞、补偿微球或抗体捕获微球*来设置。在创建补偿对照时，请注意四个基本原则：


    图1.未补偿vs.补偿的数据。利用CD3/CD28抗体刺激人CD3+T细胞7天。利用hCD4A700抗体（R&DSystems货号FAB3791N）和hCD25APC抗体（R&DSystems货号FAB1020A）对细胞进行染色。图中显示了未补偿（a）和补偿（b）的hCD4和hCD25的散点图。
    ①补偿荧光染料必须与实验荧光染料完全匹配。
    a.同一通道内的荧光染料仍具有不同的发射光谱，并且不可互换。例如，FITC不能作为GFP的补偿对照。
    B.由于复合染料的差异，实验中的复合染料标记抗体应当与补偿计算所用的抗体完全相同（来自同一支抗体）。使用相同的复合荧光染料偶联不同的抗体、甚至仅是不同批次抗体，都可能会导致计算结果不准确。
    ②补对照的亮度必须与实验样品相同或更高。
    ③对于任何对照，阴性和阳性群体的自发荧光必须相同。最好的做法是单独为每个通道的阳性和阴性群设门，避免使用通用的阴性对照。
    ④收集足够多的事件！补偿依赖于荧光强度中位值的准确计算，如果事件太少，将无法准确计算。收集数量应多于5000个。
    *抗体捕获微球与抗体重链结合,因此与生物样品不同,不需要特异性抗原识别。作为实用性补偿试剂,这些微球可提高补偿的一致性,特别适用于:
    a.阳性群体染色暗淡或稀少。补偿微球具有强烈的荧光信号，使得补偿对照的亮度与实验样品相同或更高
    b.处理多种荧光染料
    c.样品数量有限
    ③设门对照
    在分析流式细胞术的数据时，最关键的是正确设门。当细胞群体无法清晰界定或比较稀少时，需要荧光减一对照（FluorescenceMinus One，FMO）来解释流式数据并准确设门。FMO对照能够在多色实验中可靠评估背景，故它们能准确区分阴性和阳性细胞群体。
    制备FMO对照是用所有荧光抗体染色细胞，但去掉某一种荧光抗体。例如，如果利用AF488、PE、APC和DAPI开展四色实验，那么FMO对照可按照下表来设置：


    <hr/>④特异性染色体对照

    抗体与细胞结合有三种基本形式：
    a.Fab区域与抗原结合（理想情况）
    b.Fc区域与Fc受体结合（通常不想要）
    c.非特异性结合（脱靶抗原、“粘”住细胞膜等）
    在各种流式细胞术分析中，避免非特异性结合的最佳方法有:
    a.正确滴定所有的试剂
    b.封闭细胞的Fc受体
    c.加入一种细胞活性染料以排除死细胞


    <hr/>补充1：Buchon什么是同型对照？
    同型对照可用于评估因抗体类别引起的非特异性结合。同型对照是指与一抗的类别、亚型和荧光标记物一致但对目标靶点无特异性结合的抗体。通过检测背景染色，同型对照可以指示实验步骤是否需要进一步优化。同型对照可用于确定：
    ①细胞是否充分封闭：如果未完全封闭，同型对照将与Fc受体结合。如果非特异性结合的原因在于细胞存在“粘性”，特别是死细胞的存在，则可在染色液中加入DNA酶。
    ②胞内指标染色期间是否充分洗涤：针对细胞内靶标的抗体即使不与抗原结合，也常常会出现被拦在细胞内。
    补充2：什么是同抗对照
    同抗对照（Isoclonic）是指添加过量的未标记抗体，以检测非特异性结合。如果抗体是特异性的，那么过量的未标记抗体将导致荧光强度的降低。荧光若没有减少，则表明非特异性结合的存在。
    ⑤实验对照
    实验对照分为几个主要类别：
    a.生物学阴性对照用于提供所有待测标志物的表达背景。在比较细胞经过化学或生物学处理后的蛋白质表达差异时，这种对照特别重要（图2）。
    b.生物学阳性对照用于证实抗体在相关细胞中的阳性染色，以表明抗体在实验中起作用。
    c.纵向对照/参考对照是长期研究的质量控制，可以确保实验过程中的染色一致性。


    图2.诱导标志物的阴性对照。Jurkat细胞未经处理(a),或经过50uM氯喹(TocrisBioscience货号4109)处理24小时（b）。利用LC3B(1251A)抗体(NovusBiologicals货号NBP2-46892，蓝色)和匹配的同型对照(R&DSystems货号MAB1050，橙色)进行细胞内染色。用4%甲醛固定细胞,之后用0.1%皂苷透化细胞。与1ug/mL的抗体室温孵育30分钟，然后加入APC标记的兔IgG二抗（R&DSystems货号F0111）。

    二、样本制备

    各种来源的样品准备进行流式分析时需制备成单颗粒悬液，以分析活细胞或固定细胞、细胞核、微生物或小颗粒，具体取决于分析目标。拥有或开发一个好的样品制备方案，将为实验成功打下基础。在制备单细胞悬液时，主要的考虑因素是尽量减少细胞死亡和碎片。死细胞导致样品中岀现团块，这些团块往往在免疫染色中粘附游离的抗体，且表现岀更高水平的自发荧光，从而干扰荧光的准确测定。制备过程中的碎片过多则会提高噪音水平，如果过量还会干扰目标细胞的测定。
    样本制备优化
    尽管流式细胞术没有神奇的诀窍（岀自HowardShapiro的流式细胞术第零定律），样品制备是可以通过以下步骤来优化：
    1.获得并保持单细胞悬液。
    ①过滤器是从样品中去除团块的好工具。建议从40μm过滤器开始。
    ②某些染色液添加剂可减少细胞成团。
    a.EDTA（~1-5mM）可减少阳离子依赖性细胞粘附。
    b.DNA酶（~0.1mg/mL）能降解死细胞的DNA，并减少细胞粘附。
    3）从整个组织中获得细胞群体可能颇具挑战性。通常用胶原酶和胰蛋白酶来分解组织和解离细胞。避免过度消化，这会破坏目标抗原表位或影响细胞活力。

    2.了解生物样品并保持细胞活力，细胞制备的标准方案将取决于细胞来源。
    1）将细胞置于冰上并使用预冷的缓冲液，有助于维持某些细胞的活力。（注意：这未必适用于所有细胞或所有应用！）
    2）尽量减少处理时间、涡旋振荡、离心速度及次数，所有这些都会影响细胞活力。例如，外周血、淋巴组织和培养细胞在制备单细胞悬液时不要使用剧烈的处理方法。
    3）在固定之前，尽可能快地处理细胞，以便减少实验假象和细胞死亡。
    4）考虑在染色缓冲液中加入HEPES，增加CO2的缓冲。
    5）了解细胞的大小以及它们是否表达任何荧光蛋白或是否具有任何荧光特性。


    三、样品染色

    设计流式细胞术的方案和检测流程时，由于有许多变量需要优化而需要进行一些问题排查。
    在开始新的流式细胞术实验时，最好在各种条件下进行预实验，以便优化实验流程。
    在研究不同细胞或分析不同抗原时，实验方案和染色条件也许不能直接套用。
    抗体孵育的时间和温度可能影响受体染色，此步骤需要进一步优化
    （图3）。


    图3.温度对染色的影响。只有在最佳染色条件下，CCR7表位才能染上。在4°C下细胞产生了低的CCR7信号。在相同的细胞制备条件下，随着抗体孵育温度升高至室温和37°C，CCR7的检测（R&DSystems货号FAB197A）得到改善。尽管CCR7染色在37°C时最为理想，但其他受体的检测也许在4°C时最佳。


    图4.细胞密度对染色的影响。不同细胞量的CD127+T细胞经过固定浓度的CD127APC抗体（R&DSystems 货号FAB306A）染色。100万个细胞染色效果最佳，超过200万个细胞的染色会导致信号减弱。这种损失是因为抗体稀释过度，无法与所有的抗原表位结合而导致的。
    优化样品染色条件更多建议:
    1.每次都加入鉴定细胞活力的染料。
    2.滴定每批试剂,以实现最佳的信噪比(一抗、二抗、活力染料等)。在右侧的例子中,1:10的稀释显示了最佳的信噪比。



    3.细胞内染色还有一些特殊的考虑因素。
    (1）在染色细胞内蛋白时，细胞悬液需要固定和透化，然后再加入抗体。这种固定和透化处理让抗体穿过细胞膜进入细胞内部，同时维持细胞分选所需用到的形态特征


    （2）在对细胞因子等分泌蛋白进行染色时，需要蛋白质转运抑制剂（莫能菌素或布雷菲德菌素A），将细胞因子保留在细胞内。这些化合物通过破坏内质网-高尔基体转运机制，阻止新合成蛋白质的输出。对于刺激时间超过4-6小时的实验处理，分泌抑制剂可存在于整个孵育期内。若刺激时间低于4-6小时，则分泌抑制剂应在孵育的最后两小时加入
    （3）不要将复合染料用在胞内蛋白染色上-这些偶联物分子量大，较难穿透细胞膜以及从细胞中洗掉。

    参考文献
    1.NguyenR, Perfetto S, Mahnke YD, Chattopadhyay P,Roederer M. (2013) Quantifying spillover spreading for comparinginstru­ment performance and aiding in multicolor paneldesign.Cytometry A. 83(3):306-15.PMID: 23389989.2.MaeckerHT, Trotter J. (2006) Flow cytometry controls, instrument setup, andthe determination of positivity.Cytometry A.69 (9):1037-42. PMID:168887713.PerfettoSP, Ambrozak D,Nguyen R, Chattopadhyay PK, Roederer M. (2012)Qualityassurance for polychromatic flow cytometry using a suite ofcalibration beads.Nat Protoc.(12):2067-79.PMID:231383484.RoedererM. (2000) Compensation (An informal perspective). Retrieved fromwww.drmr.com5.HulspasR, O'Gorman MR, Wood BL, Gratama JW, Sutherland DR.(2009)Considerations for the control of background fluores­cenceinclinical flow cytometry Cytometry B Clin Cytom.,76(6):355-64.PMID: 19575390
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