多重荧光（多色荧光）免疫组化图像分析

大v

近几年来，多重荧光免疫组化已然成为目前研究肿瘤微环境、探索新治疗靶点、挖掘更多新的免疫治疗方案的重要技术手段之一。而多重荧光病理图像中有效信息的挖掘与分析高度依赖于分析软件。
可以这么说，多重荧光免疫组化图像如果没有软件对其分析，就好像面对一座宝藏但是没有挖掘工具。
那么多重荧光病理图像分析软件一般有哪些功能，可以分析到何种程度？
一、 免疫组化/多重荧光免疫组化定量分析

适用于免疫组化、多重荧光免疫组化的定量分析。
通过深度学习模型自动识别图像中所有细胞（或者用户通过watershed算法设置各种参数进行细胞切割，再根据实时框显示的切割效果不断调整参数的数值），再根据每个荧光的染色效果，进行参数设置识别标志物对应的染色通道中阳性表达的细胞，同时可基于染色强度，将阳性细胞进行表达强度分数分类（1 +，2 +，3+）。
结果报告可输出标志物的阳性表达百分比，H-score值，及每个细胞的完整分析数据等。


二、 表型分析

• 通过多个标志物共表达实现组织原位单细胞水平的细胞表型识别及可视化，从而对图像中各类细胞进行分型，并进行定量分析及不同表型细胞间的空间关系分析。多个指标之间的共表达得到不同的表型细胞，如调节性T细胞：CD3+CD4+FOXP3+；双阴性T细胞：CD3+CD4-CD8-。
  

可进行两标、三标甚至更多标共表达分析进而对细胞进行分型

2．软件可自动识别图像中所有共表达组合，探索发现新的表型细胞。只考虑图像中的共阳性组合，一张6标7色图像可自动检测出大约50种表型细胞，加上共阴性的组合，可得到100种以上的表型细胞。


表型分析的应用：捕捉复杂空间环境中的细胞多样性
①发现新的细胞表型
②评估免疫反应
③发现潜在的治疗目标
④研究细胞间的空间关系
⑤发现新的生物标记物
⑥探索组织免疫微环境
三、 组织区域分类

区域分割模块采用深度学习模型，经过数千张荧光图像训练实现自动区分待分析图像中的肿瘤与间质，快速地对整张切片或批量的荧光病理图像进行不同类型组织的分割，如下图所示软件自动区分的肿瘤与肿瘤间质区域。（或者用户使用随机森林算法对图像进行标注并训练，再将训练的模型应用到图像中进行处理。）
区域分割功能联合其他模块（如定量或空间分析）分析可分别得到肿瘤中的定量数据、间质及全片中的定量数据，为研究表型细胞在肿瘤微环境中不同空间位置发挥不同功能提供重要的分析方法。


四、 空间分析

在组织原位水上识别每个细胞的空间位置，根据研究目的计算两两细胞的空间位置关系并统计得到全片组织中两类不同表型细胞的空间关系。

• 空间分析--浸润分析
  

常用于肿瘤免疫浸润分析，确定某类细胞在肿瘤中的浸润情况。以肿瘤边界为分析中心，可分析靶细胞在肿瘤边界内外的分布，统计得到目标区间内所有细胞到肿瘤边界的平均距离，并给出数据统计直方图。



中间黄线为肿瘤边界，根据肿瘤边界及设定的条带参数，自动形成分析区域条带，并进行定量分析，同时输出分析的某指标距离肿瘤边界的平均距离。

如下图所示，以肿瘤边界为0轴，分析肿瘤内200um范围CD3+细胞的分布，并计算肿瘤内外每个区间的靶细胞的分布密度。



左图为浸润分析区域的点状图，红色为肿瘤边界内定量的靶细胞，蓝色为肿瘤边界外定量的靶细胞，右图每条蓝色柱状图显示该分析指标在对应区域内的细胞密度，肿瘤边界为0轴。


2. 空间分析—最近距离分析/邻近关系分析
邻近关系分析：计算某一细胞/目标物周围一定半径内另一类细胞/目标物的数量，并可将其分为n等分，计算每个等分区间内另一类细胞/目标物的数量并形成柱状图。
最近距离分析：计算某一细胞/目标物与其最近的另一类细胞/目标物的数量及平均距离。
如下图所示：计算肿瘤细胞（CK+）周围50um内CD8+T细胞的分布，并统计每5um半径区间内CD8+T细胞数量并形成柱状分布图。


五、组织芯片TMA分割

该模块对组织芯片样本图像进行切割，生成每个样本core的独立图像，进一步定量分析或空间分析，输出芯片中每个样本独立的分析数据。



自动识别组织芯片TMA样本位置并进行定位



切割后可对每个core进行独立分析

六、 三级淋巴结构（TLS）的自动化识别及定量分析

该模块通过识别组织图像中标志物的染色信息，自动调节荧光强度并识别出图像中TLS结构进行标注，进一步定量分析可得到图像中每个TLS独立的定量数据及总的定量数据，同时可进一步对三级淋巴结构的内部进行空间分析。


七、 图像配准、叠加、融合，多张病理图像融合为一张图像，实现更多通道染色

1、多重荧光图像连续切片叠加分析：
同一个样本的两张连续切片可进行叠加分析或叠加融合为一张图像，并对不同两张图像上的标志物或表型细胞进行跨图像的空间分析。



panel 1和panel 2为同一个样本两张连续切片上染的2组不同标志物的六标七色，右图为两张连续切片融合为一张图像的效果图，显示为12标13色的多重荧光图像。



如最右下图所示：两张连续切片的不同切片上的两类细胞进行空间分析。

2、免疫组化转多色荧光：
①将明场IHC图像转为伪荧光图像，可自由选择转换后的图像颜色，多张免疫组化图像可叠加融合成一张图像，通过每个标志物赋予不同的荧光颜色，叠加转换成伪多色荧光图像。适用于免疫组化的循环染色。
②不同免疫组化连续切片之间的空间分析，让免疫组化不仅仅可以做定量，还可以做空间分析。


最后放个安利
国内首款商业版多重荧光图像分析软件AP-TIME已在思路迪检验所落地应用3年，经反复迭代更新，兼具多维度功能分析模块及个性化定制潜能，同时积累的大量训练数据为AI模块的应用提供强有力的数据保障，如下图所示7项AI模块+2个自动化流程的联合应用有助于科研人员大幅提升分析数据结果的准确性，同时轻松实现多维度的快速分析。


除了以上模块化分析，AP-TIME同时具备强大的图像浏览及处理能力，多元化的注释工具，创建注释自动识别组织边界，调节通道荧光强度优化图像呈现效果，兼容主流数字切片图像格式及常规格式等等。
相比于进口软件，AP-TIME在兼具全功能分析模块的前提下配置的多项人工智能模块无需单独付费，极大降低科研人员的使用成本。在同等配置情况下，AP-TIME的价格比进口软件便宜很多。
相比于进口软件AP-TIME开发了目前全球独有的分析功能：
（以下功能是目前所有进口软件所没有的）

• 如连续切片之间（跨图像）的空间分析；
  
• 批量空间组学关系分析；
  
• 对同一图像中的不同细胞进行不同膜半径设置。
  

如果需要介绍资料和案例，可以联系我！

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