蛋白免疫印迹的应用—Western blotting

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Western blotting 用于检测和检查不同样品设置中细胞类型中存在的感兴趣蛋白质的丰度。它还可用于检测蛋白质中的翻译后修饰(PTM)。蛋白免疫印迹技术已广泛用于研究蛋白激酶的信号传导。该技术涉及在电泳仪中使用变性聚丙烯酰胺凝胶从细胞提取物中分离蛋白质。蛋白质在电场的影响下被分离，基于它们在凝胶中作为不同条带的分子量。分离后，蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 或硝化纤维素上膜作进一步处理。转移后，结合蛋白质的膜用封闭溶液处理以减少非特异性信号。然后用洗涤缓冲液洗涤膜，然后与对感兴趣的蛋白质具有特异性的一抗孵育。一抗可直接偶联辣根过氧化物酶(HRP) 或其他报告模块进行检测。然而，大多数协议使用对一抗特异的二抗 HRP 偶联抗体，并使用化学发光成像平台进行可视化。





Western blotting



Western blotting
蛋白免疫印迹技术中信号的特异性取决于所使用的抗体，因此提高特异性抗体的更好方法转化为更好的结果。大多数参与信号传导的激酶将磷酸基团添加到底物的 Ser 和 Thr 残基中。添加一个额外的基团会增加底物或下游靶标的分子量，这可以在蛋白质印迹中检测到。然而，特定的多克隆或单克隆抗体. 然而，针对底物的特异性多克隆或单克隆抗体无法区分蛋白质的磷酸化和非磷酸化状态。相反，针对磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基的抗体可用于检测蛋白质的活化状态。然而，这些抗体会检测所有磷酸化的含 Ser 和 Thr 的蛋白质，因此不会提供太多特异性。丝氨酸和苏氨酸残基可用于检测蛋白质的活化状态。然而，这些抗体会检测所有磷酸化的含 Ser 和 Thr 的蛋白质，因此不会提供太多特异性。




western blot


开发用于检测磷酸化蛋白质的更特异性抗体的另一种方法涉及在磷酸化丝氨酸或苏氨酸周围包含氨基酸残基，从而产生可以产生高度特异性抗体的短肽。针对此类含有翻译后修饰的短肽产生的抗体提供了仅检测活化形式蛋白质的机会，因此，通过适当的控制，有助于在蛋白质印迹和其他实验技术中研究信号蛋白。
为了使蛋白质条带可视化，与HRP偶联的二抗是常用的。这些抗体会与一抗结合，并通过化学发光帮助检测和捕获蛋白质条带。K. Hensley 等人早在 2000 年时进行的一项研究中发现了使用磷酸化特异性抗体研究细胞信号通路的方法，他们表明外源性 H 诱导的氧化应激Western blotting 和随后的技术，例如免疫沉淀和 pull-down 检测，通常一起用于研究信号通路中涉及的蛋白质。一抗或二抗也可以与荧光团共价连接。检测此类印迹中的条带是通过捕获抗体偶联荧光团发出的荧光而不是生化反应来完成的。




蛋白免疫印迹技术


    与传统的蛋白质印迹相比，荧光蛋白质印迹具有多项优势。主要优点之一是能够通过多重检测同一印迹中的不同蛋白质，其中两个或多个与不同荧光团偶联的二抗可以定向到它们各自对不同蛋白质具有特异性的一抗。
   蛋白质印迹的另一个应用是检测裂解的蛋白质，如半胱天冬酶，它们经过酶促裂解以激活。可以生成对裂解蛋白质特异的抗体，它们靶向仅在裂解后暴露的不同氨基。因此，这些抗体可用于仅检测活化的蛋白质对应物，从而提供更好的特异性和更多信息。
来源：苏州阿尔法生物

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