李一狗的实验报告-细胞免疫荧光染色步骤

空白派

1.固定


PBS 清洗样品。用新鲜配制的 2％（或 4％）多聚甲醛溶液在培养板中固定细胞 15minPBS 清洗样品。用新鲜配制的 2％（或 4％）多聚甲醛溶液在培养板中固定细胞 15min
防止细胞从玻片上脱落；多聚甲醛使得蛋白变性，停止细胞中的生化反应，使细胞维持状态；固定其中的各种生化物质状态，防止分解；固定细胞形态，防止其变形或破裂；除去防碍抗原-抗体结合的类脂；使标本易于保存——方便后续实验的进行。
2.清洗

PBS 洗三遍，每次 5 分钟

3.透化（检测细胞膜外侧的蛋白可忽略此步）

用 2ml 0.2-0.5％ triton X-100（PBS 配制）对细胞透化处理 10 分钟。
在细胞膜上打孔，细胞膜通透性增加，保证抗体能够到达抗原部位，选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。Triton X-100 是一种非离子型表面活性剂，能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。

• 对于核蛋白，是必须打孔的。
  
• 对于抗原和抗体结合位点在细胞膜的蛋白，不打孔也是可以的。打孔对结果也没有影响，只是多此一举。
  
• 对于跨膜蛋白，抗原和抗体结合位点在胞内的，需要打孔；在胞外的，不需打孔。
  
• 在实际操作中，在细胞样本的制作中，可能出现细胞破损，这样，在不打孔的情况下，核蛋白及在结合位点在胞内的蛋白也可能着色。
  
• 如果不知道某个蛋白是属于什么情况，要查文献。
  

4.清洗

PBS 洗三遍，每次 5 分钟

5.封闭

2％BSA 或者 10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭 30 分钟，PBS 洗两遍。
加入其他蛋白质类物质通过蛋白和蛋白的相互吸引，占据非目标带蛋白的位点，防止后续一抗的与非目标蛋白的结合。
因为血清中含有多种的蛋白或者 IgG，在加一抗、二抗之前与样本先孵育，可以借用血清中的蛋白或者免疫球蛋白 IgG 等，将样本中能够与蛋白或者 IgG 等结合的位点先占据， 这样在加一样、二抗的时候，一抗和二抗就更多是去识别特异的位点，而不会与样本的其他无关位置有非特异性结合。选择与二抗来源一致的血清封闭，是为了避免二抗与封闭的血清中的成分再次发生非特异性结合。至于 BSA 也是类似的原理，不过因为其中的成分单一， 所以相对来说封闭的效果是不如血清的。
6.一抗孵育

加入一抗，室温孵育 1 小时或在黑暗条件湿度箱内下 4℃过夜处

7.清洗

PBS 洗三遍，每次 5 分钟

8.二抗孵育

加入二抗，室温孵育 30-45 分钟。（具体孵育时间应通过预实验确定

9.清洗

PBS 洗四遍，每次 5 分钟

10.封片及观察

加入 0.5 ug/ml DAP（I  PBS 配制）染色 10 分钟（这里也可用其它的染核染料）；
用 PBS 洗三遍，去除多余的 DAPI；加入 20 ul 封片剂封片。在显微镜下观察，注意荧光强度随着灯光刺激衰减，尽快照相。
注意事项：

• DAPI 强烈致癌，操作时要戴上手套。
  
• 贮存液用 70%酒精配制，浓度 100 μg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000 用 PBS 稀释，最终浓度 100 ng/ml。
  
• DAPI 是非常优秀的 DNA 染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用 DAPI 染色
  

11.保存

封片好的细胞样品可于 4 度冰箱中存放 2 周以上。

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