推文组织形态学免疫组化免疫荧光四部曲之--免疫荧光

wolf

1 背景知识介绍
免疫荧光(Immunofluorescence, IF)是一种利用荧光团可视化各种细胞抗原(如蛋白质)的免疫组织化学技术。通俗易懂的描述就是将已知抗体或抗原分子标记上荧光素（经常听讲的488/555/594 .etc），当与其相对应的抗原或抗体起免疫反应结合，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素信号，在荧光显微镜下就评估荧光的抗原-抗体结合情况，从而实现对蛋白的定位，根据荧光强度（相同的曝光条件）可判断蛋白的相对表达量。IF和免疫组化（immunohistochemistry, IHC）免疫结合原理类似，但是IF能够根据荧光基团的不同收集到五颜六色的漂亮结果，而IHC一般情况下就是棕色（brown），但IHC片子保存得会更久此从展示效果来说IF的展示性更好。因此，在IF推文中，我们不在讲述过度的理论知识，需要了解相关理论知识可参考《组织形态学免疫组化免疫荧光四部曲之—免疫组化》。


（图1 免疫组化和免疫荧光基本原理示意图）
2 IF实验实操
2.1 准备工作
移液枪、恒温箱、水浴锅/微波炉（抗原修复使用）、免疫组化笔、计时器、湿盒、盖玻片、中性树脂等。
2.2 实验操作步骤
（1）组织切片脱蜡：二甲苯中浸泡10分钟×3次，消除组织和组织周围的石蜡；
（2）组织复水：无水乙醇10分钟-95%乙醇 10分钟-75%乙醇10分钟，蒸馏水1分钟，然后置于PBS缓冲液中；
（3）组织通透，使用0.3%的TritoX-100，在室温（25℃）通透组织15-20min，完成抗原修复以后使用阻断笔将组织画圈；
（4）封闭：滴加100μL或适量的封闭工作液，室温孵育10-15分钟，倾去封闭液，可不用清洗；
（5）一抗孵育：根据组织块大小，添加适量一抗工作液，4℃孵育过夜，轻轻的洗涤3次，每次5min（组织在经过上述液体处理以后，特别容易脱落，所务后续操作必轻柔）；
（6）荧光标记二抗孵育：添加对应种属适量荧光标记二抗，室温（25℃）孵育1-2h，PBS润洗5分钟共3次；
（7）DAPI染核：使用2μg/ml浓度的DAPI对上述组织切片进行染色，室温（25℃）孵育15-20min，PBS润洗5分钟共3次；
（8）封片：将组织切片中的水分使用吸水纸吸取干净后，使用甘油明胶封片液或者40-80%甘油进行封片（建议使用商品化的甘油明胶封片液，紧急情况下可使用40-80%甘油进行封片。）
（12）数据采集：荧光容易淬灭，所以完成上述实验步骤以后，尽快采集荧光数据，建议在3h内完成数据的采集，数据采集过程中组织切片放置暗盒中，一定不要放在光照中，这会导致采集的数据不准确。
3. 结束。
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