用质谱是怎么研究蛋白质的？

good

质谱原理我懂，我知道用质谱如何研究小分子的有机物，但我不知道蛋白质这么大的分子是怎么通过质谱确定结构的。以前做有机分子结构解析习题的时候，如果是质谱图，都是小分子，不到十个碳原子。如果再大一点，比如十几二十几个个碳的分子，都是要加上别的谱图，比如IR，才能解出来的。我今天忽然听见有个老师说他研究方向是用质谱解析蛋白质结构，当时我就震惊了，蛋白质是成千上万个甚至更多个碳原子啊，而且结构那么扭曲那么复杂，谱图得复杂成什么地步啊！读那样的一个密密麻麻的谱图真能解出分子结构？怎么做到的？我当时问了一句，老师你们组是不是还用别的仪器啊，比如NMR或者红外紫外之类，老师说不，我们只用质谱。然后就匆匆走了。我下巴都快惊掉了。谁来给我科普一下用质谱解析蛋白质结构是怎样一个过程？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/59067644

队长是我

利用质谱鉴定MHC结合肽用于新抗原肽的发现和肿瘤疫苗的开发

Identification of MHC peptides using mass spectrometry for neoantigen discovery and cancer vaccine development
作者：Rui Chen, Kelly M.Fulton, Susan M. Twine, Jianjun Li
作者单位：加拿大国家研究委员会人类健康治疗学研究中心
Mass Spectrometry Reviews 2019,00,1-16 doi 10.1002/mas.21616
分享人：河中海绵-晔
河中海绵-晔：这是与免疫原性相关系列文章中的第8篇中，为发表在Mass spectrometry reviews杂志上的综述。
文献仅限于知识传播，不作他用，侵删。
采用由MHC呈递的新抗原肽的免疫治疗是癌症治疗中最有希望的方法之一。使用这种方法，癌症疫苗可以被设计为靶向在正常组织中没有被发现的肿瘤特异性突变。临床试验表明，注射从免疫肽组中选择的合成肽后，显现出增强的免疫反应和肿瘤的消除。尽管MHC结合的多肽的序列可以通过基因测序和预测算法预测，但这种方法会产生大量的预测多肽，这需要通过质谱分析进行确认。通过免疫肽组的直接MS分析对MHC肽的鉴定是准确且灵敏的，有可能从肿瘤细胞系或肿瘤组织鉴定出数以万计的独特多肽。这些突变多肽还可以通过由基因组或者转录组序列数据构建的患者特异性的蛋白数据库确认。MS分析还可以进行那些抗原的翻译后修饰（PTM）的表征，具有翻译后修饰的抗原通常不能被预测到。此外，抗原的翻译后修饰被认为能更加有效的触发免疫反应。本文除了回顾利用MS对新抗原鉴定的近期进展外，还讨论了该项技术用于癌症候选疫苗的选择和处方、疫苗的递送系统、在和其他治疗药物联合使用的可能性。在未来的癌症疫苗的开发中，可以预见基于MS的技术将具有重要的作用。
1、介绍
肿瘤新抗原是由肿瘤MHC分子呈递的突变的自身多肽。如果它们被适应性免疫系统认为是非自身的新抗原，则它们可能是具有免疫原性的。这些基于突变的MHC结合肽（MAPs）的肿瘤疫苗已经被视为有效的肿瘤特异性T细胞反应的关键靶标，且能够排异先前产生的肿瘤。在近年来，高通量测序技术的发展，包括全基因组测序、下一代RNA测序，和基于MS的蛋白组学，已经使得测序数据的爆发和数千的肿瘤相关基因和MAPs被鉴定。其中一项开创性的工作是，全外显子和转录组测序分析联合基于MS的蛋白组学来鉴定新抗原。在MC-38和TRAMP-Cl分别发现1290和67个氨基酸的改变，而经过人工验证和与合成肽的比较，借助质谱，我们发现只有7条肽（MC-38有7条，TRAMP-C1有0条）被MHC呈递。在荷瘤小鼠接种突变的肽后，与未处理的对照组或溶剂组对比，显现出可测量的和持续性的肿瘤生长抑制。所以，用具有预测的新表位的简单的肽疫苗产生足够的T细胞免疫来排斥先前产生的肿瘤。基于新抗原的癌症疫苗的有效性在临床试验中进行了进一步测试。例如，97条独特的新抗原用于患者黑色素瘤的治疗，疫苗介导多功能的CD4+和CD8+T细胞分别靶向于58条（60%）和15（16%）条多肽。这些T细胞从野性型抗原中区分了突变肽，且在一些情况下，可以直接识别自身肿瘤。6位接种疫苗的患者中的4位在接种后25个月无复发，而2位复发的患者随后接受抗PD-1治疗，实现肿瘤完全消退并伴随新抗原肽特异性T细胞库的扩增（Ott等，2017）。在另一项临床试验中，个性化的新抗原靶向疫苗被用于免疫新诊断患有胶质母细胞瘤随后经手术切除且疾病处于Ⅰ/Ⅰb期接受常规放射治疗的患者。接受癌肿疫苗的患者产生循环多功能新抗原肽特异性的CD4+和CD8+T细胞反应，这种反应富含于记忆表型并显示肿瘤浸润T细胞的增加。使用单细胞T细胞受体分析，证明了来自外周血的新抗原特异性的T细胞可以迁移到颅内胶质母细胞瘤内。因此，新抗原靶向性的疫苗具有改善胶质母细胞瘤的免疫环境的潜力。这些临床前研究和临床试验证明癌症疫苗的MAP在治疗血液肿瘤和实体肿瘤上具有广阔的前景，而MS已经成为新抗原发现和验证的重要工具。
因为新抗原是DNA损害和/或DNA修复机制的随机错误导致突变的结果，所以肿瘤新抗原必定是高度个性化-特异性的。作为新抗原个性化的本质的结果，潜在的候选疫苗抗原只有在经过肿瘤突变组学的分析才能被确定。基于MS的免疫肽组学已经具备鉴定肿瘤相关抗原的能力，具有精准确定携带突变的MAP的能力。当前的研究旨在从整个蛋白编码基因评估MAP的产生程度，并检测特定的特征是否影响非连续的基因产生MAP的能力。通过蛋白组学，研究者从18个个体的B淋巴细胞鉴定到了25270个MAP。有趣的是，这些呈递的MAP库只覆盖了10%的在B淋巴细胞中表达的外显子序列，而41%的表达基因在免疫肽组中没有呈递在免疫肽组中。该研究小组后来报道，主要MAP大约有10%来源于所谓的非编码基因组序列或外显子帧外翻译（exonic out of flame translation）。那些MAP显现出不同MHC-Ⅰ结合偏好，且拥有更多的基因组多态性。此外，MS可以提供翻译后修饰信息，包括糖基化和磷酸化。
在本篇综述中，我们聚焦于MS在新抗原的鉴定和PTM的表征方面的应用。我们讨论了样品富集和纯化、化学衍生和标记、不同液质联用平台的试验设计，和用于数据分析的生物信息的策略。利用选择反应检测模式（SRM）的靶向的定量蛋白组学在新抗原鉴定和验证已经非常引人注目。本文还讨论了LC-SRM平台在癌症疫苗开发中的潜力，包括抗原验证、呈递效率和传递策略的优化。
2、MHC肽的样品制备
样品制备是基于MS的免疫肽组学的关键，因为生物样品中含有复杂的基质且样品数量很少。在MAP分析的样品制备的挑战之一就是从不同类型的样品中分离低丰度的多肽，用于那些携带突变的多肽的序列的鉴定。图1提供了从组织样品和细胞培养基中进行基于MS的MAP鉴定的工作流的概况。如图所示，肿瘤组织和血液从患者采集后用于外显子和转录组测序从而建立包含患者特异性突变的个性化蛋白库。MHC-Ⅰ的免疫肽组是通过识别HLA的抗体免疫共沉淀从肿瘤/细胞裂解液分离的。分离出来的MAP通过反相色谱分离和数据依赖性采集（DDA）的LC-MS/MS分析。根据已建立的数据库检索MS/MS数据，以鉴定新抗原。当新抗原的序列被MS确认，基于多肽的癌肿疫苗通过合成和使用PBMC测试它们的免疫原性。MS设备的近期进展，包括改进的灵敏度、采集循环和数据非依赖性分析（DIA）的实施，使得可以直接从临床样品以蛋白组学方式进行新抗原的鉴定。对于B淋巴细胞癌，新抗原可以通过EBV（Epstein-Barr virus）永生化的B细胞鉴定，该细胞可通过体外扩增增加用于免疫共沉淀或者中等酸洗脱的材料的量。


图1 基于质谱的新抗原发现的流程图。从患者收集肿瘤组织和/或血液用于外显子和转录组的测序从而建立包含患者特异性突变的个性化的蛋白数据库。使用识别HLA的抗体的免疫共沉淀从肿瘤组织/细胞裂解物中分离出MHC-Ⅰ型的免疫肽组。被分离出来的MHC Ⅰ型结合肽通过RP-LC-MS/MS分析进行DDA数据采集。根据从已建立的数据收索MS/MS数据来鉴定新抗原。序列已验证的新抗原会被合成并用PBMC测试它们的免疫原性。
A.MHC肽的分离
利用质谱进行免疫肽组的分析需要大量的细胞，大约需要5×108个MHC的表达率大约为2×105个分子/个的细胞。因此确保能高效和特异性地从细胞中分离出MHC是关键的。免疫共沉淀（IP）和中等酸洗脱是最为广泛使用的方法，尽管这两种方法都需要大量的起始材料。据报道，高达90%的免疫纯化的肽是MHC复合物特异性行的。然而，免疫共沉淀的产量是相对较低的（0.5-3%），因为MHC复合物的裂解和纯化过程中肽会丢失。已经开发了一些新的方法在免疫共沉淀前通过分离膜复合物提高临床样品免疫共沉淀法的产量。据报道，从少至1×108个细胞鉴定出有来自215个蛋白的384个核心序列中的1434条独特的肽，相当于在EBV-B和BAL细胞中每一百万个细胞分别鉴定到了10.9条和9.4条多肽。在鉴定人类MAP的大多数应用中，已经使用具有广泛亲和力（HLA-A、B、C）的分离抗体。这种免疫共沉淀具有高度特异性和灵活性的优势，可以用于从多种生物来源的材料（比如培养的细胞，原代组织和血浆）中分离Ⅰ类和Ⅱ类MHC肽。相比而言，MAE是一种费用低且可快速富集MHC肽的方法，通过酸缓冲液裂解复合物从而洗脱MHC肽。但这种方法缺少选择性，鉴定的肽中大约有40-60%含有与HLA非特异性结合的污染物。在先此前已经报道了在2种不同的B淋巴细胞模型中对比了IP和MAE这两种方法，包括回收率、重复性、可测量性和两种方法在鉴定方面的互补性（Lanoix等，2018）。对比的结论是：IP的重复性数据显示从2-100×106个细胞提取获得肽中鉴定到2016-5093种MAP。相比于MAE，IP获得MAP肽的数量增加了6.4倍。也获得了两种方法对不同肽偏好的互补性的结果。因此，在免疫肽组研究中联合这两种方法，是可能增加免疫肽组的覆盖率和自信度的，特别是对具有PTM的MHC肽的鉴定。
对于MAE和IP两种方法，为了纯化MAP，洗脱溶液是需要浓缩和脱盐处理的。这一步骤通常是使用反相C18的固相萃取小柱以及在处理HLA-肽复合物的时候使用大体积的冲洗。进一步的清洗是必需的，因为这一步骤的样品依然含有大量的完整的HLA和β2微球蛋白，这些物质会减少样品上样量并导致下游的LC-MS/MS问题。一种经典的解决方法是使用膜过滤器来去除高分子量的蛋白保留更小的肽。虽然这种方法可以有效地从免疫肽组样品中去除蛋白，但非特异性吸附会导致肽的损失。另一种可选的策略是使用内含C18的小离心柱（Bassani‐Sternberg等，2015）。肽被低浓度的有机相洗脱（如30%的乙腈），而蛋白依然保留在柱上。这种方法增加了肽的产量且以及成功用于临床样品LC-MS/MS的分析（Bassani‐Sternberg等，2016）
B.MHC肽的预分离
免疫肽组分析的主要挑战之一是肽的生物化学性质差异大和肽的丰度低。即使是纯化策略和LC-MS设备的改进，常规情况下也难以从临床样品获得足够多的配体用于重要肿瘤免疫治疗的新抗原的鉴定。预分离方法作为一种增加HLA配体组覆盖率的有效方法在此进行介绍。比如，强阳离子交换（SCX）已经被广泛用于MAP的LC-MS/MS分析。通过SCX-LC-MS/MS，比一维的分析方法多鉴定到了3倍的肽。然而，在HLA配体组的预分离中，SCX的效率依然是很低的，因为HLA-Ⅰ型呈递的肽通常比胰蛋白酶酶切肽短，所带的电荷更少且不能直接用于LC-MS鉴定。为了克服这一问题，高pH反相色谱可作为SCX的补充策略（Denners，2019）。这两种预分离方法实质上拓宽了可检测的HLA Ⅰ型配体。尽管每种预分离方法会引入鉴定偏差，但高pH的反相色谱和SCX预分离可以互为补充。我们渴望有其他可用于HLA配体组深度分析的其他方法，比如多孔碳和亲水作用色谱，这些方法能提高那些低疏水性的肽的分离效率。
C.MHC肽分析的化学标记和衍生
肽的化学修饰作为一种有效提高蛋白鉴定的方法已经用于基于质谱的免疫肽组研究。例如串联质谱标签（TMT）用于标记MAP来进行MS定量分析（图2a）。在这种方式当中，肽的含有一级胺的N端或Lys残基被标记上标签。有报道称，TMT标记能够提高肽的碎片化，增加低水平的肽鉴定。MHC Ⅰ型肽具有有限的氨基酸个数（9-11个），与胰蛋白酶酶切肽相比，在C端缺少碱性氨基酸。更短的MAP序列使得其疏水性更弱，这导致在反相色谱上保留相对更差，且在上样过程中更容易丢失。因为缺少正电荷，MAP的离子化效率一般是较低的，这会影响MS/MS试验中肽碎片的模式。近期研究显示，自然状态下的肽的2种化学衍生物可以显著增加免疫肽组的覆盖率（图2b）。经过纯化的MAP首先在N端和Lys残基被二甲基化，然后再在羧基端进行烷基酰胺化。结果显示，二甲基化增加了肽的疏水性和MAP的离子化效率。相比而言，烷基酰胺化显著提高了肽的碎裂，在MS/MS中产生更多y系列的离子。因此二甲基化和烷基酰胺化样品的分析能够鉴定到在自然状态下通过MS不能鉴定到的肽。当关联自然状态、二甲基化的和烷基酰胺化的肽的结果，我们从HCT116细胞系中鉴定了3148中独有的MAP，而没有经过修饰的，只鉴定到1388种肽。在这些鉴定到的肽中，鉴定到10个高度确信的携带突变的肽，这表明在，化学衍生策略是一种有前景的方法用于临床应用中的新抗原发现。


图2 MHC结合肽的化学衍生和标记。a)串联质谱标签（TMT）标记在N端和Lys残基，可用于临床样品的MAP定量；b)一种2步法衍生法，先是在N端和Lys残基进行二甲基化衍生，然后在C端羧基端进行烷基酰胺衍生。序列的衍生化显著提升了序列中缺少Lys和Arg的MAP的鉴定。
D.具有PTM的MAP的富集
在临床试验中作为治疗疫苗使用的大多数抗原是来自DNA突变的肽，目前还缺少以具有PTM的MAP作为新形式的新抗原的研究。在恶性细胞而非健康细胞中已经发现PTM水平的增加或改变，特别是信号传导失调和异常的糖基化。已经发现PTM影响抗原处理和MHC的呈递。因为PTM不能通过基因组和转录组测序所预测，因此具有PTM的MAP的鉴定只能依靠质谱技术，特别是样品制备和设备的最新进展。磷酸化是在开发了固定化金属离子亲和层析（IMAC）（可以从复杂的样品中选择性富集磷酸化的肽）后最先从HLA配体组在MHC呈递的肽中鉴定的PTM。在Hunt团队开发的早期工作中，从4种细胞系使用混合线性-四极子离子阱傅里叶变换质谱仪鉴定了36种磷酸化的MAP。在随后的研究，他们又鉴定了95种呈递在原发性血液系统肿瘤和正常组织的表面的磷酸化肽，包括61种肿瘤特异性的磷酸肽。已经证实，磷化的MHC Ⅰ型肽可以触发来自CD8+细胞毒性T细胞的反应。而且，那些磷酸化特性的CD8+T细胞系在体外可以识别和杀死白血病细胞系和HLA匹配的原发性白血病细胞。这些结果表明磷酸化肽的鉴定对于疫苗和T细胞过继转移免疫疗法的开发非常重要。这也表明联合IMAC和金属氧化物亲和层析的富集技术增加了磷酸化的MHC肽的鉴定（因为两种方法对磷酸化肽的选择性有差）。一项最近的研究表明，MAP的磷酸化广泛存在于黑色素瘤组织，这些磷酸化的大多数在此前的全蛋白组中没有被鉴定到（图3）。因此，这些磷酸化的位置和序列特征被发现是HLA类型无关的（HLA allotype-independent），这使它们可能成为广大患者人群的通用抗原而备受关注（图3d）。


图3 从磷酸化的MHC 肽鉴定到的磷酸化的位点的分布。a)在两个或两个以上患者中检测到的磷酸化HLA肽的百分比。b)PhosphoSitePlus数据库中已知的磷酸化位点的比例。c)磷酸化配体中默认磷酸化位点的比例d)磷酸化的HLA肽的磷酸化位置与肽长度的关系图，肽长度分别为9至12个氨基酸。e）磷酸化的HLA肽在每个位置上的残基概率图。
异常的糖基化也是癌症的独特特征。在癌症细胞表面的不同的癌症抗原是N-糖基化的。然而，因为N糖的大分子量的尺寸，被修饰的肽不会被呈递在MHC Ⅰ型分子上。相比而言，O-乙酰氨基葡萄糖基化，具有一个乙酰氨基葡萄糖（GlcNAC），连接到被呈递的肽的Ser或Thr残基上，从通过硼酸衍生化的POROS微球免疫共沉淀和富集，在HLA Ⅰ型配体组中被鉴定到。在体外的酶切试验确认了O-乙酰氨基葡萄糖的存在而非N-乙酰半乳糖胺。在健康捐献者中，71%的已鉴定到的O-乙酰氨基葡萄糖基化的肽与多功能记忆T细胞反应有关。有意思的是，这种对肽进行修饰的新的O-糖链的分子量高达1021Da。此外，在黑色素瘤细胞中发现了N-糖基化的MHC Ⅱ型肽。这些观察到的糖基化是多样的，三种黑色素瘤细胞系和一种EBV转化的细胞系的93种糖肽具有17种不同的糖型。令人惊讶的是在这些肽中还检测到了二硫键。随着新的富集方法、串联质谱碎裂技术和生物信息化工具的发展，可能会有更多形式的糖基化的MHC肽被鉴定出来。其他PTM，比如甲基化，乙酰化等，在大规模的免疫肽组研究中也有报道，虽然它们的免疫原性还没有研究清楚。尽管如此，这些研究表明新抗原的翻译后修饰是开发癌症疫苗非常重要的目标。
3、MAP的LC-MS/MS的分析
用在传统的自下而上的蛋白组的LC-MS/MS方式已经广泛用于MHC肽的鉴定和定量。纯化的MAP通常上样到反相色谱柱上并通过5%-30%乙腈梯度分离。这种方式在鉴定突变的MAP（图4a）和不能通过基因组/转录组预测的其他形式的MAP，如肽在蛋白酶体中的剪切（图4b）、非编码区的翻译肽（图4c）和具有PTM的肽，均以获得成功。


图4 鉴定到的MHC肽的MS/MS图。a)具有突变的MHC肽；b)蛋白酶体剪切的肽；c)非编码区翻译的MHC肽；d)磷酸化的肽。
正如上文所述的，大多数的MAP肽是短于胰蛋白酶酶切的肽，疏水性低故不需要高浓度的乙腈就可从反相色谱柱上全部洗脱。已报道的MAP的分析通常是采用高分辨的质谱完成的，比如混合线性离子阱-Orbitrap、Q-TOF、QE。因为MAP是非胰蛋白酶酶切的，所以数据库检索过程是没有设置固定特异性酶切位置的，这通常需要更长的数据检索时间。高分辨MS/MS试验可以减少数据库检索时间和减少假阳性率，因为（精确的分子量使）搜索引擎产生的候选序列更少。QExactice已经成为受欢迎的MHC肽分析设备，因为它可以同时保证高灵敏度和扫描速度，这相对于混合线性离子阱Orbitrap可以增加免疫肽组的覆盖率。混合线性离子阱Orbitrap在离子碎裂模式上具有优势，比如可以提供EThcD，这是一种对鉴定糖基化的肽非常有用的技术。和分析胰蛋白酶酶切肽相比，MAP的质谱分析的其他差异，还包括具有更多的比例的单电荷离子，在一些情况下MAP单电荷离子的比例高达30%。这一点是和其他大多数常规蛋白组试验相反的，常规蛋白组试验中，胰蛋白酶酶切肽的分析通常观察到的是两电荷和三电荷的，且在仪器设置上经常在MS/MS中会排除单个电荷的离子。在其他研究中，通过增加MS/MS的离子注入时间来增加碎片离子的信号，这可以提高低丰度肽的鉴定。虽然这些进步都已经用于MAP的LC-MS/MS的鉴定中，但是传统平台的设置仍然需要进一步的优化。我们分析了已发表的MAP序列和结果，表明大多是的LC-MS/MS系统对序列中含有Lys和Arg的肽具有偏好性，接近70%的已鉴定的MAP含有这两者中的一种或两种。因此，可以预见现有的LC-MS/MS系统需要通过化学衍生、更好的色谱方法和更佳的MS/MS的操作来提高对不含K或R的MAP的检测来增加免疫肽组的覆盖率。
A.MAP鉴定的数据依赖性（DDA）和非依赖性采集（DIA）
目前已报道的大多数免疫肽组研究使用DDA采集MS/MS图谱。使用DDA模式，最新一代的质谱仪能够在数小时内鉴定成百上千的MHC Ⅰ类肽或Ⅱ类肽。在这种模式下，离子化的MHC肽，首先进行全扫描（MS1 扫描），然后丰度最高的母子（Top N）被选中进行碎裂。相应肽产生的碎裂离子被记录为碎裂离子（MS2图谱）。虽然目前已经鉴定出有大量的MHC肽，但是依然还有大量的产于免疫肽组而没有归属出来的MS/MS图谱且只有10%采集到的MS2图谱可以确信归属到多肽的序列（错误发生率小于1%）。确信归属的MS2图谱的确切比例，可能很大程度上依赖于实验室，且也受所用设备的采集参数影响（如测量长度、阈值设置和样品数量）。相比于完整蛋白的胰蛋白酶酶切肽的50%的鉴定成功率，MAP相对较低的鉴定成功率，大约只有10%，归结于肽的长度较短和非胰蛋白酶酶切的性质。实际上，许多Ⅰ型肽离子化效率低，因为缺少碱性氨基酸残基，在标准的碎裂方法下产生信息匮乏的MS2图谱，这也为序列的归属带来了挑战。此外，MHC肽鉴定中使用DDA，特别是无标签的鉴定，重复性较差。
为了克服这些限制， DIA的出现，加速了免疫肽组的破译。这种采集模式是将所有的肽从物理状态的样品转变为一种由来自于所有母离子碎片的多重度MS2图谱组成的永久性数字图谱。我们可以收集全面的数据，并可以回顾性地挖掘定量的信息。DIA也已经显示出在多次进样中比DDA具有更好的重复性，这增加了来自生物样本的MAP的无标签的定性分析的准确性。遗憾的是，当前的DIA方法依然要求使用DDA模式构建的序列数据库，这使得它仅适用于DDA鉴定的MHC肽的定量。预计在MS仪器上的最新发展，如diPASEF，是在新型的离子淌度质谱配备了线上平行累积连续碎裂技术（PASEF），这将有利于MAP的DIA采集，因为该技术使离子的利用最大化且可以累积弱的母离子信号。
B.MAP的MS/MS碎裂
如前文提及的，和传统胰蛋白酶酶切肽相比，MAP的氨基酸组成导致了通过MS使用CID具有较低的鉴定率。Orbitrap质谱仪提供了可替代的碎裂方式，比如LTQ-Obitrap可以提供ETD和HCD。在混合LTQ-Obitrap质谱仪上联合CID、HCD和ETD可以提供互补的碎片，这可以提高MS/MS的鉴定。最新版本的混合LTQ-Obitrap质谱仪可以使用EThcD，可以产生两种系列的碎裂离子并促使大量的多肽骨架碎裂。在EThCD中，包含未反应的母离子在内的所有的离子经过初始电子转移解离后，再经过高能碰撞诱导解离，在单一图谱中产生b/y和c/z类型碎片离子。相比于使用CID的10%的鉴定率，将EThcD应用于免疫肽组的分析使得MS/MS的鉴定率达到了35-39%。这种方式还显示了增加了MAP磷酸化位点的可信度。EThcD能够准准确鉴定有O-GlcNAC结构的O糖基化的MAP。虽然EThcD在提高肽的鉴定率上有优势，但是也只是对具有高电荷（≥2）的肽的鉴定有效。对单电荷占总免疫肽组30%的MAP不能有效鉴定。联合EThcD和化学修饰可能是一种可能的解决方案，因为在此时（衍生化后）大多数的MAP具有更电荷状态。有趣的是，在与混合LTQ-Obitrap质谱仪相同的裂解方法下，四极杆Obitrap质谱仪HCD获得了更高的鉴定率（30-40%），这是因为四极杆Obitrap质谱仪能够鉴定更多数量的独特的MAP。近期的一项研究显示，似于ETD的ECD已经引入到四极杆Obitrap质谱仪，可以替代混合LTQ-Obitrap的ETD，这种组合鉴定MAP的潜能还需要进一步的评估。因此，我们有理由假设，在传统的LC-MS/MS实验中丢失了许多肽的片段和鉴定，并且仍然需要持续的评估和应用新的碎裂技术，以实现更完整的免疫肽群覆盖。
4、用于MAP鉴定的生物信息学
为了开发有效的个性化免疫治疗产品，准确预测和鉴定患者特异性的可以触发免疫反应的新抗原是非常重要的。对于基于质谱的方法，蛋白组学的方法已经广泛适用于促进不同来源的新抗原的鉴定，如突变、非规范区（non-canonical frames）、非编码区、蛋白酶体剪切的肽等。一般情况下，一个特定的和个性化的蛋白和肽的数据库是由基因组和转录组序列构建的。不同实验室已经开发出一些新的方法和工作流程来促进新抗原的鉴定，这将在下文讨论。
A.数据库的构建
对于携带突变的MAP的鉴定，个性化的蛋白数据库通常建立于与患者肿瘤和正常细胞的DNA相匹配的全外显子测序。比较这两个样品可以进行肿瘤特异性的体细胞突变的鉴定。通过RNA测序对转录组（RNASeq）的进一步分析，可以帮助来确定表达了哪些DNA的突变并确认那些仅依靠DNA测序难以确定的突变。特异性的蛋白/多肽数据库也可以通过测序建立，但是这要求额外的分析。例如，对来自B细胞的RNA序列数据的6帧翻译建立了一个全帧的多肽数据库，方法是使用计算机对具有33个碱基对的移动窗口通过质量过滤器形成6种可能的阅读框进行翻译。对于来自非编码区域翻译的肿瘤相关抗原，通过联合有外显子序列编码的蛋白和使用非对齐的RNA序列工作流产生的癌症特异性的蛋白组构建的蛋白数据库，能够检测任意基因组来源的任何阅读框编码的肽。免疫肽组中蛋白酶体剪切的肽的数据库的构建是更复杂的，且要求对可能的剪切位点的预测，而通过最近的研究表明这会导致高的假阳性结果。总之，建立个性化的蛋白质数据库可支持用作癌症疫苗的抗原的鉴定。


图5患者特异性的蛋白数据库构建的工作流程，可用于鉴定来自非编码区翻译的MHCⅠ结合肽。a)用于鉴定常规的（Conv.）和非常规（Crypt.）的MAP的蛋白质组工作流程整体概况。多肽从B-LCL细胞表面洗脱下来，然后通过LC-MS/MS测序。为了测定这些肽的氨基酸序列，通过对来自B-LCL的RNA-seq数据的分析建立了两个蛋白数据库：对照库（control DB）和全帧库（all-frame DB）（详见Laumont等2016的文章的方法部分和补充材料中的图1）。b)从全帧数据库鉴定到的肽被认为是候选的Crypt. MAP，然后通过进一步的过滤去除假阳性和不确定的肽。
B.数据库检索
已经有多个数据库搜索引擎用于MS数据集中的MHC肽的鉴定和定量。对比用于免疫肽组研究的开源的（如X!Tandem、MS-GF+和Comet）和商业化的数据库（如Masco和Peaks）搜索引擎，可以发现大多数搜索引擎对相同的MS数据鉴定到的相似数量的MAP。然而，值得指出的是，一些搜索引擎在已发表的研究中应用的频率更高。Mascot被用于来自不同的样品的MAP的鉴定且显示Mascot Percolator可以进一步提高鉴定到的数量并减少FDR。在其他的对比研究中，相比于MS-GF+、X!Tandem、Comet和Mascot，Peaks可以鉴定到了更多数量的独特的肽。Peaks的一项优势是它允许使用者设置多种多样的PTM且能够从免疫肽组中发现未知的PTM。商业化的软件Byonic能够从HLA Ⅰ型结合肽中鉴定到O-GlcNAC。Maxquant是一种利用高分辨质谱数据对MAP鉴定的强大的搜索引擎，它能够无标记定量（LFQ）HLA结合肽的表达量的改变从而研究抗原在不同的条件下的呈递。还有一种新的强度测定和标准化程序被称为MaxLFQ，能完全兼容LC-MS分析前的任何肽或蛋白的分离。
对于定量MAP表达水平，采用峰的强度是当前最为流行的方式。O’Connell等进行了一项采用基于LFQ和基于TMT的定量方式对胰蛋白酶酶切混合物的比较，结果显示LFQ缺失值数量更高，更适合于统计低丰度的肽。Murphy等开发了一种利用TMT筛选治疗诱导的MHC-I配体的复合平台，并将其应用于测量对阿霉素的反应，这种反应被认为在癌症患者的治疗过程种能促进抗肿瘤的CD8+T细胞反应。对TMT标记的解释需要Proteome Discover™进行定量分析，这需要利用多个搜索引擎（SEQUEST、Z-Core、Mascot和Byonic）进行序列鉴定。（http://www.thermofisher.com）。当前的搜索引擎的一个缺点是它们都是为了鉴定胰蛋白酶酶酶切肽开发的，这经常导致MHC肽的低鉴定率和高错误发现率。当采用严格的1%的FDR，许多潜在的免疫肽组可能会被过滤掉。在一些临床研究中，采用较为宽松的标准，允许使用5-9%的FDR来增加鉴定到的肽的数量。
一些计算机方面的考量被开发出来，以来增加免疫肽组研究的质量和产量。Murphy等构建的SpectMHC程序简化且靶向潜在的MHC配体数据库。通过限制参考蛋白质组的大小，SpectMHC还减少了虚假诱饵命中的次数。这种靶向的研究策略使得小鼠和人的配体中肽的鉴定能力提高了2倍，结果优于传统的参考蛋白质组的“无酶”搜索。通过训练高可信度肽谱匹配（PSMs）的预测模型，MS-rescue学习了与MHC特异性相对应的序列基序。通过将这种考量应用到Peaks8.5的检索结果，使鉴定到的配体的数量增加到了20-30%，同时有效的去除了假阳性和共沉淀的产物。一种类似的方法也被Blatnik等用于鉴定乳头瘤病毒的表位。
C.MHC肽结合亲和力的预测
由MHC Ⅰ型分子呈递在细胞表面被细胞毒性T识别的肽是免疫系统对疾病做出反应的关键。为了开发基于新抗原的癌症疫苗，最为重要的步骤是预测可以被抗原处理途径所处理、由MHC呈递至细胞表面且能被T细胞识别的新抗原的序列。一些生物信息工具已经被开发出来，让人们通过计算机分析DNA和RNA序列数据并精准确定携带突变的序列。NetMHC 是最早的且非常流行的一种工具。最新版本的NetMHCpan-4.0，是一种在结合亲和力和洗脱配体数据上进行训练并充分利用来自这两种数据的信息的方法。一种新发布的预测器，MHCflurry1.2.0在预测速度上具有优势，是7000点预测/s的NetMHCpan4.0的396倍。它采用MS数据集进行模型选择，这表明MS在新抗原鉴定中具有的重要作用。人们还开出了其他特定应用的工具。ScanNeo是一种快速简洁计算机方面的软件，用于分析RNA-seq来预测新抗原从小到大的插入缺失衍生的新表位。NeoPrePipe(Neoantigen Prediction Pipline)提供了假定的新抗原预测和相应的识别潜力。在一项报告的评估中，Bonsack等比较了13种算法的性能，并通过体外竞争结合试验实验验证了它们的HLA结合。在计算多肽的实际结合能力的基础上，通过计算ROC和曲线下面积（AROC）来分析预测算法的性能。没有一种算法优于其他算法，但不同的算法对特定的HLA类型和肽长度预测最好。
机器学习已被广泛应用于提高MHC I和MHC II结合的准确性，从而识别肽结合的非典型模式。人工智能领域的新技术已用于增强新抗原的预测。Phloyphisut等提出了一种基于预测算法的神经网络，用于通用MHC结合预测。EDGE（Epitope Discovery in cancer Genomes）一种商业平台，利用深度学习将HLA抗原预测的阳性预测值提高了9倍。EDGE可以通过常规临床样品来进行新抗原和新抗原反应性T细胞的识别。当使用来自单等位基因HLA的基于MS的免疫肽组数据时，可以获得了更高的结合预测准确性。在癌症疫苗开发中，可以期待结合计算机预测和MS鉴定对新抗原选择将更加准确。
D.新抗原鉴定的验证
MS在新抗原的发现和验证过程中都具有重要的作用。在人群中鉴定那些被最主要的MHC Ⅰ型分子呈递的抗原肽是相对容易的，而在人群中鉴定那些具有较低表达的抗原是困难的。与DDA形成对比，靶向的数据采集方法，对于肽的测定可以提供高专属性、灵敏度、重复性、定量准确度和宽的动态范围（接近５个数量级）（图６），且已经应用于MAP的灵敏度的检测和稳健的定量。不幸的是，SRM受限于每次进样检测数百条的能力，因此不能完美的适用于全面定量免疫肽组。然而，SRM能够分析由癌症细胞呈递的较低丰度的内源性的新抗原肽。更重要的是，它对验证基于MHC肽的癌症疫苗的呈递是极为有用的，因为疫苗处方由合成肽组成且SRM转换参数可以预先确定。实际上，这项方法技术可以用于测定一个已知的抗原肽是否是自然加工和由超型中具有多种MHC Ⅰ型分子呈递，还可以用于确认新预测的表位是否是自然加工和呈递在任一特定的MHC Ⅰ型分子上。
五、新抗原用于癌症疫苗的开发
临床试验已经证明在注射来自患者的免疫肽组的合成肽后会增加免疫反应并清除肿瘤。然而，在免疫原性新表位的有效鉴定和肽的高效、安全的递送以触发强大和稳健的抗癌症的T细胞反应方面依然具有显著的挑战。当前新抗原的预测方法没有考虑免疫系统中个体化的差异，还没有稳健的方法来预测这些预测的新抗原的治疗有效性。MS分析中的DDA模式已经从临床样品成功鉴定了各种的新抗原。因此，预计在新抗原定量方面具有高灵敏度和准确性的DIA可以在癌症疫苗的设计、处方和递送方面发挥关键作用。MS在癌症疫苗开发中的作用如图7所示，并在本节中进行了讨论。


图6 用于MHC结合肽（MAP）定量分析的SRM开发试验。a)经分离的免疫肽组样品的LC-MS/MS分析，DDA采集；b)通过数据库检索鉴定目标肽的序列；c)SRM的转换和LC-SRM的优化；d)样品的LC-MS分析和统计分析。


图7 液相色谱-质谱（LC-MS）/质谱技术在癌症疫苗开发中的应用。
A.抗原的优化和设计
当前，处于开发中的大多数的基于新抗原的癌症疫苗是靶向具有体细胞突变的肿瘤特异性的新抗原。因此疫苗被设计成长合成肽或或可以翻译、加工和呈递的mRNA。混合多种肽的疫苗相较于单条肽的处方已经显示更好的有效性，因为它们不太可能触发免疫逃逸。此外，长肽（定义为20-30个氨基酸），而不是预测结合到MHC Ⅰ型分子上的8-10个氨基酸的肽，获得了人们更多的注意，因为它们需要APC细胞内化和加工，进而提供了T细胞的最佳激活方式。长肽通常包含MHC Ⅱ型限制性肽，因此具有同时刺激CD4+和CD8+的潜力。
基于mRNA的疫苗是另一种递送方式，结合了mRNA可以编码几乎任何蛋白的潜力且具有出色的安全性、灵活性和辅助能力。在一个临床Ⅰ/Ⅱ试验中，皮内接种可以编码若干肾细胞癌的TAA的mRNA疫苗，使一些患者体内产生了T细胞反应和适当的抗肿瘤活性。最近，Krwiter等发现淋巴结内接种个性化的mRNA突变疫苗的结果显示基于RNA的多新抗原表位的方法可以在具有黑色素瘤的患者体内触发针对新抗原的强大抗肿瘤免疫。
B.抗原递送
组成新抗原疫苗的肽需要呈递到APC上才能有效激发适应性免疫反应。这需要共同给药的佐剂作为抗原传递的一部分。有一些报道的现有和新型佐剂的例子，结合新抗原肽正在作为潜在的癌症疫苗被测试。
在Khong等研究中，一种基于L-Tyr的微球被开发出来，作为一种肽疫苗的辅料，具有短期抗原存储功能，以H2Db限制性异质小鼠gp100 25-33肽（KVPRNQDWL）诱导肿瘤特异性的T细胞。在一项类似的研究中（Kuai等，2017），相比于TLR9激动剂联合montanide，合成的高密度脂蛋白（HDL）纳米片中的共递送的肽和辅料诱导超过30倍的肽特异性的细胞毒性CD8+T细胞，这被认为是在临床中使用的最强的佐剂中一种。新抗原靶向的疫苗联合基于STING的佐剂ADU-V16在小鼠胰腺癌模型的肿瘤内产生疫苗特异性的T细胞并导致短暂性肿瘤消退。采用RNA形式的递送系统也被开发出来用于癌症疫苗。一种合成的可生物降解的材料，电荷改变的可释放转运体（Charge-altering releasable transporters,CARTs）被开发出来用于将mRNA递送到细胞内。CARTs是结构上是独特的，且通过新的机制运作，起初是复杂的、可保护和递送mRNA的寡聚阳离子（α-氨基酯）。CART随后通过降解改变它们的物理性质，电中性的分子内重排，导致在胞内释放的功能性的mRNA并高效地翻译的蛋白质。也有报道称（Oberli等，2017），一种脂质纳米颗粒制剂用于递送mRNA疫苗，以诱导细胞毒性CD8+ T细胞应答。对于癌症疫苗处方，无论是以RNA或长合成肽的形式，都应监测细胞表面MAP的表达和呈递，以确定肽呈递的有效性。
癌症疫苗的处方的全面评估要求所使用的方法能够直接定量（细胞）内化的（抗原的）种类，研究它们的胞内稳定性和位置，并测定其生物活性。MS已经用于测定细胞穿透肽的胞摄取和递送的效率，以及分析载体和抗原的胞内降解。使用LC-SRM可直接测量所呈递的肽的水平，因此无需测试肽在未自然加工并与目标MHC I类目标分子结合的情况下刺激CTL反应的能力。
C.与其他免疫治疗联用
由于肿瘤发生的复杂性和癌细胞逃离我们的免疫系统的能力，一个单一的治疗方法并不足以有效地治疗癌症。研究表明，一种癌症疫苗可以与其他治疗方法相结合，如检查点阻断。直接针对PD-1和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）信号通路的单克隆抗体已经在广泛的实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中显现出临床有效性。有报道称，新抗原的合理性，即新抗原被主要的MHC呈递和随后被T细胞识别的可能性，可以用于预测接受抗CTLA-4治疗黑色素瘤的患者和接受抗PD-1治疗的肺癌患者的生存。MHC肽的分析也具有使人们理解癌症免疫逃逸机制的价值。例如，在非小细胞肺癌患者对免疫检查点阻断剂抗PD-1或抗CTLA-4抗体产生初始反应后出现获得性耐药性期间，对匹配预处理和耐药性肿瘤的分析识别到基因组的改变，导致在耐用肿瘤中丢失了7-18种认为与突变相关的新抗原。更重要的是，产生于被消除的新抗原中的多肽在自体T细胞培养中可以诱导克隆T细胞的扩增。
相较于检查点阻断免疫治疗，包含的突变位点的合成的长肽疫苗可引发肿瘤排斥。质谱提供了一种有利的方法来测量免疫检查点阻断期间的突变形势的动态。研究证实，在对逐渐生长肉瘤的小鼠抗PD-1和/或抗CTLA-4治疗后，肿瘤特异性突变蛋白成为主要的T细胞排斥抗原。这些结果表明，肿瘤特异性突变抗原是检查点阻断治疗的重要靶点，将已鉴定的新抗原与常规免疫治疗相结合可以提高治疗效率。LC-MS也可用于探索不同的检查点阻断治疗的机制基础。
六、总结和观点
在疫苗的开发中，关键是将正确的疫苗递送给APC，这很大程度依赖于通过计算机预测而设计的合成肽的序列。虽然基因组和生物信息学的发展已经在靶向新抗原的预测有了优势，但是对于癌症疫苗的开发仍然需要互补的技术。在MAP鉴定和可用于癌症疫苗的开发的新的抗原的发现中，MS已被证明是一种强大的技术。该技术能够测定在蛋白酶体中剪接的肽，从非编码区翻译的肽，以及不能从基因组序列预测的具有PTM的肽。靶向质谱技术，特别是多反应监测（MRM），也就是在三重四重仪器和轨道仪上的SRM和Orbitrap上的平行反应监测（PRM），已在蛋白质组学领域广泛应用于临床样本中蛋白质（肽）的定量评估。LC-SRM非常适合于测定APCs在体外呈递的多肽的数量。基于MS的定量分析可以通过监测呈递在APC上的肽水平，在疫苗配方的优化中发挥重要作用，包括传递载体和佐剂。
LC-SRM还提供了检测内源性低丰度MAP的可能性，作为一种验证从mRNA序列中预测的肽序列的新策略。该技术可提供新抗原表达水平的定量信息以及给患者接种合成肽后抗原呈递的定量监测。预计定量在APC中呈递的MAP的MS技术将在癌症疫苗处方的开发和递送系统的优化中发挥重要作用。此外，使用MS来监测MAPs的变化或检测化疗和放疗期间新的突变抗原的出现，将有助于设计治疗策略。在联合免疫治疗中，对于监测治疗效和最大限度地减少免疫逃逸的影响，MAP的动态和形态提供了有价值信息。
虽然可以预见，基于LC-MS/MS的技术将在基于新抗原的癌症疫苗开发的下一阶段发挥更重要的作用，但仍有一些未得到解决的问题。其中一个主要的挑战是，MS检测的灵敏度不足以从有限的患者来源的材料中获得有意义的信息。与传统的胰蛋白酶酶切肽相比，MAP的电离效率较低，在反相色谱上的性能相对较差、MS/MS碎片较差，这仍然有需要生物信息学和分析方法不断取得进展才能支持新抗原和癌症疫苗的发现和转化。

清风寡欲

前言
在前面的第二讲中，我们已经了解到质谱（mass spectrometer）作为一种称量分子”质量”的利器，能够对目标物进行定性和定量分析，具有高通量、高灵敏度、分析速度快等特点，几乎已成为科研及检测机构必备的神器，被广泛地用于各种领域。我们接着上一讲——蛋白质组学中样品制备流程，继续简要介绍质谱检测的一般过程。
样品引入
蛋白质组学领域中，质谱通常与液相色谱联用，达到进样和分离的目的。目前市面上的液相色谱仪型号众多，外观也各不相同，但内在主要构造和进样过程并无本质差别。水相和有机相（统称流动相）混合后通过高压泵注入，样品通过自动进样系统注入，并被流动相带入分析柱进行结合，随着流动相中有机相的比例逐步提升，分析柱中结合的蛋白被逐渐洗脱下来，最终到达质谱的前端——离子源。



（LC的基本结构和过程）

色谱仪中有一个非常关键的小部件——六通阀，可用于控制进样，切换样品和流动相的注入。

采样六通阀工作原理_哔哩哔哩_bilibili感兴趣的小伙伴如果理解了它的工作原理，相信对液相的进样过程会有更清晰的认识。
质谱检测
样品经过液相后，就会到达质谱进行检测，目前蛋白质组学中常用的质谱仪器主要有Sciex公司的TripleTOF，Thermo公司的Orbitrap系列，以及Bruker公司推出的目前4D蛋白质组学质谱新锐timsTOF系列。虽然不同型号的质谱外观各不相同，但其内部结构非常相似，都具有离子源（Ion source）、质量分析器（Mass analyzer）、检测器（Detector）三大部分。用于蛋白质组学检测的高分辨仪器中，通常会采用电喷雾离子源，并串联使用两个甚至更多不同的质量分析器。



（Orbitrap Exploris 480的硬件结构）

下面主要以Orbitrap Exploris 480为例，简要介绍一下质谱检测的大致过程：
首先，液相导入的样品会源源不断地经过电喷雾离子源（Electrospray Ion Source），在高电压下雾化成带电液滴。带电液滴中的溶剂迅速被气化，液滴体积逐渐缩小，其电荷密度超过表面张力极限时会引起液滴“库仑爆炸”。随着溶剂进一步蒸发，最终形成带正电荷的气态肽段离子。


气态肽段离子随即进入高容量离子传输管（High Capacity Transfer Tube）和电动离子漏斗（Electrodynamic Ion Funnel），这个过程可捕获和聚焦离子并进行离子传输。


离子通过离子传输管和离子漏斗之后，会进入轴向弯曲设计（能防止中性或不需要的离子进入四极杆，从而提高稳定性降低噪音）的主动离子束传输系统（Advanced Active Beam Guide ）和分段式四极杆（Advanced Quadrupole Technology），四极杆可通过施加直流电压/射频电压，从而实现对离子的选择和传输，也是目前主流质谱仪通常串联使用的第一个质量分析器。     


随后，离子会被转移至弯曲线性阱（C-trap），与氮气发生碰撞而失去动能，从而得到冷却，同时C-trap会通过其轴线上产生的电势阱，将离子挤压进质谱的核心部件——Orbitrap质量分析器（Orbitrap Mass Analyzer）中。


在离子阱质量分析器中，肽段离子或碎片离子会在电场作用下会围绕中心电极的径向和轴向做谐波振荡，由检测器检测各个离子的共振频率和信号强度，根据傅里叶变换公式根据共振频率计算各离子的质荷比，从而绘制形成一级谱图和二级谱图。除了Orbitrap质量分析器，在TripleTOF和TimsTOF系列使用的飞行时间质量分析器（Time-Of-Fly Mass Analyzer）中，不同质荷比的离子具有不同的飞行速度，因此到达检测器的时间不同。检测器会检测不同离子的飞行时间和信号强度，计算离子质荷比后绘制质谱谱图。
至此，质谱基本完成一个扫描循环中的一级全扫描分析（Full Scan Analysis），得到一级质谱图（MS1 spectrum）。
进行完一级扫描后，质谱随即通过四极杆，选择特定的肽段离子，经过C-trap进入多级离子通道（Ion Routing Multipole），通过高能碰撞解离（high energy collision dissociation，HCD）将肽段离子的肽键随机断裂形成b/y离子，返回C-trap之后，离子被注入 Orbitrap进行二级质谱分析（MS/MS Analysis）。


如果是DDA扫描模式，会根据本次扫描循环中采集到的一级谱图，选择信号较高的肽段离子依次破碎采集二级谱图。如果是DIA扫描模式，则会根据预设的质荷比窗口，选择一定质荷比范围内的所有肽段离子进行破碎和采集二级谱图；而若是PRM扫描模式，则是选择确定好的特定质荷比的肽段离子进行破碎和采集二级谱图。
质谱检测完整的数据采集过程由很多扫描循环组成，每个样品的检测总时间与其串联的液相色谱中样品洗脱梯度时间保持一致。如下图DDA扫描模式所示，每个扫描循环会采集一张一级谱图和数十张二级谱图。



（数据依赖采集，DDA）

总结
本篇承接上一讲的样品制备过程，主要向大家介绍了蛋白质组学研究中的重要环节——质谱检测，该环节的质控好坏很大程度上将影响蛋白鉴定的多少和定量结果的准确与否。质谱检测分为液相部分的样品引入和质谱部分的扫描分析，本篇以Orbitrap Exploris 480为例，着重介绍了质谱仪的数据采集过程。近年来质谱仪器硬件及其采集方式方法在不断地更新换代，在传统的3D蛋白质组学（即利用色谱-质谱获得的保留时间（Retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（Intensity）3个维度的信息，辅助完成物质的定性定量）的基础上，还进一步开发出可采集离子淌度（ion mobility）信息辅助样品分离和蛋白定性定量的4D蛋白质组学，进一步提高了针对复杂样品、微量样品或修饰鉴定等特殊需求样品的检测深度和灵敏度。下一篇将介绍质谱检测的下一个环节——数据库搜索。

继续前进

质谱（Mass Spectrometry，MS）是一种强大的分析技术，可用于研究蛋白质的质量、结构、修饰和相互作用等方面。以下是用质谱研究蛋白质的几种主要方法：

1.蛋白质质量分析：质谱可用于测定蛋白质的质量，从而验证蛋白质的纯度和一致性。这种方法通常使用基于矩阵辅助激光解吸/电离（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）或电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）的质谱技术。

2.蛋白质鉴定和肽段测序：质谱可用于蛋白质鉴定和肽段测序。通过对蛋白质进行酶切（如Trypsin酶切），产生肽段。然后使用液相色谱（如高效液相色谱，HPLC）对肽段进行分离，再用质谱进行检测。最后，通过比对数据库，鉴定蛋白质的序列和来源。这种方法通常使用串联质谱（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）技术。


3.翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）分析：质谱可用于检测和定位蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、泛素化等。通过对修饰位点进行定量分析，可以研究蛋白质的功能和调控机制。

4.蛋白质相互作用分析：质谱可用于研究蛋白质之间的相互作用。例如，可以通过免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）或亲和纯化（Affinity Purification）等方法富集蛋白质复合物，然后用质谱进行蛋白质鉴定。这有助于揭示蛋白质之间的网络和通路。

5.定量蛋白质组学：质谱可用于定量研究蛋白质的表达水平。通过标记（如同位素标记，如iTRAQ、TMT等）或标记自由（如标签自由定量，LFQ）方法进行蛋白质定量分析，可用于研究生物学过程、疾病状态和药物干预等条件下的蛋白质表达变化。定量蛋白质组学可以帮助了解生物学现象、病理过程以及药物作用机制。


6.结构生物学：质谱在结构生物学中也有广泛应用，如氢/氘交换质谱（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry, H/DX-MS）用于研究蛋白质的结构和动态性。此外，质谱也可用于研究蛋白质折叠、构象变化以及与其他生物大分子的相互作用。

7.顶点定向蛋白质酶切（Top-Down Proteomics）：顶点定向蛋白质酶切是一种不需要对蛋白质进行酶切的质谱方法，直接对整个蛋白质分子进行测量。这种方法可以提供关于蛋白质的详细信息，包括翻译后修饰和剪切等。然而，由于其对质谱仪性能的高要求和数据处理的复杂性，目前顶点定向蛋白质酶切的应用相对较少。

8.蛋白质组学技术的发展：质谱技术不断发展，蛋白质组学研究也在不断推进。例如，新的数据独立采集（Data-Independent Acquisition, DIA）方法提高了质谱分析的准确性和可重复性。此外，质谱在研究蛋白质与小分子、药物筛选和药物靶点鉴定等领域也具有广泛应用。

相关技术文章分享：
蛋白质质谱鉴定
蛋白测序
定量蛋白组分析

更多科研干货，实验资讯，欢迎关注“百泰派克生物质谱”公众号

大力水手

高分辨质谱仪是分析多肽乃至蛋白质的主要分析手段。主要思路就是先把蛋白质立体结构破坏，再用几个特异性酶水解肽链，然后LC-MS分离和检测，通过精准的分子量信息，结合强大的数据库比对，基本是可以分析出氨基酸组成、连接顺序和二硫键数目、修饰的糖型分析等。当然也有不水解蛋白质的，直接进质谱，这样得知的信息量很少了，只是知道其分子量，无法得知氨基酸组成和排列顺序了。
得知巯基数目和二硫键具体连接位置，这对蛋白质的空间结构也是很有帮助的。但据我所知，解析蛋白质的空间结构主要手段是X-衍射和液体NMR，前者需要将其培养单晶，后者需要将其溶液化，即溶解；还需要借助强大的编辑程序和算法。总体来说，蛋白质的立体结构解析还是非常具有挑战性的。
“老师说不，我们只用质谱。然后就匆匆走了。”你这句话很有画面感了，可以细品，哈哈哈。

队长是我

今天刚听了Prof.Carol讲座
原理部分自己也不是特别清楚
可以查查她的工作