求解！想知道 PCR 技术的基本原理吗？

会里很

生物学可划分为两个时代：无 PCR 的时代，以及有 PCR 的时代。若无 PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）技术，便无现代分子生物学。PCR 技术的发明者 Kary Mullis，于 1993 年荣获化学诺贝尔奖，举世公认其为 PCR 教父。
    生物体内的基因组存于 DNA 分子之中，然而分析此类遗传信息需大量的 DNA。1985 年，Kary Mullis 创造出一种行之有效的手段，能够在较短时间内大量复制少量的 DNA。借由加热，DNA 分子的两条链会被分隔开来，同时添加的 DNA 组件会与每条链相结合。凭借酶 DNA 聚合酶，新的 DNA 链得以形成，此后该过程还可重复进行。PCR 在医学研究与法医学领域均具重要意义。
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于放大特定 DNA 片段的分子生物学技术。
其主要包括以下三个步骤：

• 变性：将双链 DNA 加热至 95°C 左右，使其解离为单链。
  
• 退火：将温度降低至特定的退火温度，使引物与单链 DNA 特异性结合。
  
• 延伸：在合适的温度下，利用 DNA 聚合酶沿着引物延伸合成新的 DNA 链。
  

原理

• 以亲代 DNA 的两条链分别作为模板：在 DNA 聚合酶的催化下，按照碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的 DNA 分子。
  
• 新形成的两个子代 DNA 与亲代 DNA 的碱基顺序完全一样：由于子代 DNA 分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制。
  

PCR相关技术
1锚定PCR（Anchored PCR）
    常用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。
2不对称 PCR
    基本原理是采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物,结果产生大量的单链 DNA(ssDNA)。这两种引物分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是1/50～1/100,因为 PCR 反应中使用的两种引物的浓度不同,因此称为不对称PCR。
    不对称 PCR 主要为测序制备 ssDNA,其优点是不必在测序之前除去剩余引物,因为量很少的限制性引物已经耗尽。多数学者认为,用 cDNA 经不对称 PCR 进行 DNA 序列分析是研究真核 DNA 外显子的好方法。
3 多重PCR(multiplex PCR)
    多重PCR是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。多重PCR技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性，而是在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性。应用于基因诊断，对与疾病相关的基因（庞大）进行扩增检测。
4 原位PCR(In situ PCR)
    原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。
    基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测。优点：灵敏度高，可进行细胞内定位。
5 差示反转录 PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）
     简称为ddRT-PCR。它是将 mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
    目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。mRNA 差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。
6 荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）
    是一种在 PCR 反应体系中加入荧光标记，通过对荧光信号的实时监测来实现对模板定量分析的技术。
其主要原理包括以下几个方面：

• 荧光标记：使用荧光染料或荧光标记的探针，与扩增产物结合。
  
• 实时检测：在 PCR 反应进行时，不断检测荧光信号。
  
• 扩增产物增加：随着扩增循环的进行，扩增产物数量增加。
  
• 荧光信号增强：与扩增产物结合的荧光染料或探针数量也增加，导致荧光信号增强。
  
• 定量分析：通过荧光信号的强度变化，精确地定量分析起始模板的数量。
  

    这种技术具有以下优点：

• 高灵敏度：可检测到极微量的目标核酸。
  
• 高准确性：准确测量目标核酸的数量。
  
• 实时性：实时监测反应过程，及时获得结果。
  
• 高特异性：特异性结合目标核酸，减少非特异性扩增的干扰。
  

    它广泛应用于生物学、医学等领域，如基因表达分析、病原体检测、疾病诊断等。

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