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[分享] 原位杂交技术新进展,一文了解!

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发表于 2024-10-9 10:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

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摘要

1.原位杂交(ISH)是一种广泛使用的方法,用于定位和定量各种细胞学和组织学制剂中的DNA或RNA,并保留细胞和组织的形态。
2.ISH是一种极其灵活的技术。事实上,可以选择DNA或RNA探针,这些探针可以带有放射性、荧光或抗原标记的碱基,进而进行显色(CISH)或荧光检测(FISH)。
3.该技术的新进展克服了其主要局限性:灵敏度,尤其是在检测单拷贝目标时。Enzo Life的AMPIVIEW™ RNA探针采用LoopRNA ISH™技术,是检测组织和细胞中核酸靶标最灵敏的方法之一,而且不会破坏样本的形态。
简介

原位杂交(ISH)是一种广泛使用的方法,用于定位和定量细胞学制备物(中期染色体涂片、细胞、组织)甚至全胚胎(WMISH)中的DNA或RNA。它的正式诞生可追溯到1969年,当时两个独立的研究小组使用体内产生的放射性标记RNA作为探针,检测爪蟾卵母细胞核中的互补DNA(1,2)。第一代探针所使用的放射性标记技术看起来很有前途,但由于许多限制因素,如标记所使用同位素的半衰期本身较短,或更重要的是与放射性有关的安全和环境问题,其应用一直相当有限。自这些开创性工作以来,分子生物学技术的巨大进步使ISH越来越实用,用途也越来越广泛。如今,ISH已成为一种重要的实验室工具,常规应用于从基础研究到临床诊断和预后等多个领域。为了实现这种灵活性,人们可以选择DNA或RNA探针,它们可以带有荧光或抗原标记的核苷酸。检测方法是显色(CISH)还是荧光(FISH),也可根据所需的分析类型进行调整,其中CISH更适用于分子病理学诊断,可同时观察目标和标本形态,而FISH通常是多重分析和基因组畸变研究的选。
本综述将介绍ISH基本原理,该技术的新进展,并说明这些进展如何在个性化医疗时代进一步扩大ISH的应用范围。
ISH工作原理

具体方案严格取决于样品类型、研究目的、探针性质和所选检测方法,ISH程序可归纳为几个要点:
探针生成:在杂交阶段作为诱饵使用的探针是与相关序列互补的DNA或RNA片段。在合成过程中,可以通过加入与标记物共轭的核苷酸对其进行标记。
标本制备:将感兴趣的细胞或组织固定保存。组织通常嵌入石蜡并切成薄片。然后将标本固定在玻璃载玻片上并进行渗透,使探针能接触到目标序列。
变性:样本中的探针和核酸都会受热变性,为随后的杂交阶段做好准备。
杂交(或退火):包括探针与样本中的互补 DNA/RNA 序列自发配对。
检测:探针与其目标物之间形成的杂交可以利用不同类型的标记进行可视化。
如下所述,根据研究目标的不同,需要采用不同的探针类型和检测方法。
探针类型

杂交可以在互补的脱氧核苷酸或核糖核苷酸之间进行,因此可以使用DNA或RNA探针来定位特定样本中的DNA或RNA。然而,这些不同类型的探针并不等同,我们必须为实验选择最合适的方案。例如,RNA-RNA杂交探针比RNA-DNA杂交探针更稳定,而RNA-DNA杂交探针又比DNA-DNA杂交探针更稳定。根据ISH目标的不同,稳定性的差异会影响探针性质的选择。
DNA探针是含有相关染色体区域特异核苷酸序列的DNA片段。其最常见的合成方法之一是切口平移反应,分两步进行(图1A)。首先,用低浓度的DNAse I酶处理模板DNA(通常是细菌人工染色体[BAC]),使其随机缺口,产生一个游离的3′-OH基团。在第二步中,DNA聚合酶I将通过5'-3'外切酶活性去除核苷酸,同时拉长3'-OH基团,后者将作为引物。然后,反应混合物中经过修饰的核苷酸将被整合到新合成的链中,从而对探针进行标记。聚合酶链反应(PCR)是合成DNA探针的另一种常用方法:可以在有适当标记引物的情况下扩增感兴趣的序列(末端标记PCR,图1B),或者在反应混合物中加入标记的dNTPs,使反应产物在合成过程中被标记(连续标记PCR,图1C)。基于DNA的ISH更常用于检测细胞核中的特定DNA序列,例如识别潜在的基因扩增、缺失、易位和染色体数目。
RNA探针是一段单链RNA,用于通过杂交检测互补核酸序列的存在。RNA探针可通过体外转录高效、稳定地生成。常用的方法是在两个方向相反的启动子之间克隆要转录的DNA,以便使用适当的聚合酶合成有义或反义RNA。在这种情况下,RNA探针在转录过程中会通过加入修饰的核苷酸而不断被标记,从而产生标记加入度很高的探针(图1D)。此外,由于RNA探针是由线性化模板合成的,因此所有探针分子的长度都是一致的。与DNA探针相比,RNA探针具有信号更强的优势。然而,由于RNA本身的易变性和易受RNase降解的影响,RNA探针必须与其他任何RNA制剂一样小心处理。RNA ISH主要用于研究细胞水平的基因转录和基因表达。



图1.DNA探针(A-C)和RNA探针(D)最常用的合成方法。

标记类型和检测方法

如前所述,ISH探针是用荧光团或抗原修饰的核苷酸标记的。这种差异与检测方法有关。
含荧光团的探针可在荧光原位杂交(FISH)中直接进行荧光检测。FISH是一种高灵敏度的技术,可以使用不同的荧光团来观察同一标本上的多个目标位点。FISH可用于染色体制图和计数,以及检测结构重排,如易位、倒位、插入和缺失。然而,当需要组织形态学信息时,FISH可能会受到限制,因此染色体检测可能是shou选。
CISH(显色原位杂交)通常与间接检测和使用生物素或地gao辛标记探针有关。
生物素是放射性标记核苷酸的第一个替代物,因为它可以利用其与亲和素或链霉亲和素的高亲和力结合,进而与报告酶[碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)]结合显色。生物素也可被特异性抗体识别,其下游检测系统与IHC/IF基本相同。不过,生物素探针标记可能会导致染色问题,尤其是在内源性大量表达生物素的组织中,如肝、肾、骨骼肌和心肌等。
针对这一问题,与地gao辛结合的探针是一种有效的替代方法。地gao辛是一种从洋地黄属植物中提取的类固醇抗原(3)。由于它只存在于这些植物中,因此避免了生物素可能带来的背景问题。检测是通过与地gao辛抗体特异性结合进行的。此外,地gao辛和生物素标记还可以在多重检测中结合使用,例如,可以同时使用两种不同的原位探针,或者将显色ISH与IHC结合使用。
用于单分子可视化的RNA ISH的进展

早期诊断和个性化治疗是现代医学面临的两大挑战。因此,DNA、RNA和蛋白质生物标记物的定量和定性分析在临床实践中的作用日益突出,为诊断、预后和治疗指导提供了重要信息(4)。基于DNA的ISH和IHC通常应用于这一领域,而基于RNA的ISH仍仅限于高表达基因(如EBER1/2)(4),其主要局限在于该技术的灵敏度,尤其是在检测单拷贝目标时。例如,通过使用“经典”RNA ISH,宫颈阴道涂片中HPV的检测很容易被漏掉,因为感染通常是由标本中少量细胞中病毒基因组的单一整合引起的(5)。因此,RT-PCR通常被认为是临床诊断(以及任何研究领域)基因表达分析的黄金标准,因为它可以检测到非常有限的相关序列。然而,与ISH不同的是,RT-PCR需要将样本均质化以提取DNA/RNA,因此无法提供有关基因表达的任何空间信息。
为了克服这些局限性,多年来人们不断改进ISH技术,试图提高其灵敏度。最常见的方法是通过使用支链DNA(bDNA)(4,6)来增强检测能力,其最普遍的应用是使用成对的Z-探针(或双Z-探针)。如图2所示,Z-探针由三个元素组成:与目标RNA互补的序列(杂交所必需)、间隔物(连接物)和Z-探针尾部。Z探针与前置放大器序列配对,后者又与多个放大器结合。最后,几种标记探针(显色或荧光)附着在放大器分子上的特定位点上(7)。只有当两个Z探针同时与目标物退火时,才能进行检测,而信号放大过程可使灵敏度极高,从而确保了该系统的特异性。



图2.成对的Z-探针放大技术示意图。

尽管这种形式的bDNA技术有许多明显的优势,但它的某些方面仍然会构成制约。例如,由于扩增需要多个步骤,因此程序相当长。杂交条件也可能很苛刻,从而改变组织或影响其他标记的可视化。最后,它的总体成本较高,较小的实验室不太容易使用。
AMPIVIEW™ RNA探针

Enzo Life自1986年开发出第一款用于ISH的非放射性HPV探针以来,一直被视为标记和检测领域的先驱,如今再次推出基于LoopRNA专利技术的 AMPIVIEW™ RNA探针,为该领域做出进一步贡献。如图3所示,在LoopRNA ISH探针(LRP)中,与目标序列配对的区域穿插着多个与目标序列不互补的RNA间距片段。这些间隔的设计使其大部分碱基可以用生物素或地gao辛标记。当这种探针与目标序列杂交时,标记的间隔区段就会环出,然后就能被报告系统识别(5)。由于存在多个生物素或地gao辛分子,报告基因很容易通过环路接触到这些分子,从而使信号得到强力放大,确保了极高的灵敏度。由于杂交无需经过多个扩增步骤,因此与上述bDNA系统相比,杂交过程更快、更简便。此外,AMPIVIEW™探针不需要任何特殊设备,可用于手动或自动程序。
关于检测,与标准的ISH检测一样,可以是直接或间接检测。当探针用生物素标记时,可直接使用与报告酶连接的链霉亲和素(直接或一步式方案)。在间接(或两步)方案中,抗生物素或抗地gao辛抗体可和即用型POLYVIEW® PLUS AP或 HRP检测试剂结合使用,产生高强度显色,染色清晰。



图 3. AMPIVIEW™ RNA 探针设计和信号放大方式简图。

Enzo Life的第一批AMPIVIEW™ RNA探针是针对HPV的。La Rocca博士等人证明,基于LoopRNA技术的ISH探针可以检测HPV DNA和RNA,甚至可以检测到单拷贝基因组整合的HPV。这些结果与另一种市售的双Z探针进行了比较,表明AMPIVIEW™ RNA探针具有同等或更优越的性能(5)。文章还强调了LoopRNAs 的另一个相关特性,即可以合成与有义序列(与病毒基因组DNA互补)和反义序列(与基因组DNA和RNA转录本互补)相对应的探针,以便区分基因组DNA和病毒主动转录的RNA。
AMPIVIEW™ RNA探针实际上可以针对任何基因组中的任何基因进行设计。例如,在COVID-19大流行期间,俄亥俄大学的Nuovo博士使用AMPIVIEW™探针检测了COVID-19患者不同组织中SARS-CoV-2 RNA的表达,比较了病毒基因组的存在和四种特征性病毒蛋白(包膜、穗、膜和核帽)的存在(8)。
参考文献:
1.Gall JG & Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. PNAS (1969). PMID: 4895535.
2.John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature (1969). PMID: 5799530.
3.FarrellJr RE. Nucleic Acid Probe Technology. RNA Methodologies, Ch 12. (2020). Full Text.
4.Wang F et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn (2012). PMID: 22166544.
5.La Rocca G et al. Recent improvements in in situ hybridization for the detection of HPV infections in clinical samples. WCRJ (2020). Full Text.
6.Player AN et al. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J Histochem Cytochem. (2001). PMID: 11304798.
7.Atout S et al. Evaluation of the Suitability of RNAscope as a Technique to Measure Gene Expression in Clinical Diagnostics: A Systematic Review. Mol Diagn Ther (2022). PMID: 34957535.
8.Nuovo GJ et al. A Standardization Protocol for the In Situ Detection of SARS-CoV2 RNA and Proteins. Appl Immunohistochem Mol Morphol. (2022). PMID: 35175238.

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