Enzo Life自1986年开发出第一款用于ISH的非放射性HPV探针以来,一直被视为标记和检测领域的先驱,如今再次推出基于LoopRNA专利技术的 AMPIVIEW™ RNA探针,为该领域做出进一步贡献。如图3所示,在LoopRNA ISH探针(LRP)中,与目标序列配对的区域穿插着多个与目标序列不互补的RNA间距片段。这些间隔的设计使其大部分碱基可以用生物素或地gao辛标记。当这种探针与目标序列杂交时,标记的间隔区段就会环出,然后就能被报告系统识别(5)。由于存在多个生物素或地gao辛分子,报告基因很容易通过环路接触到这些分子,从而使信号得到强力放大,确保了极高的灵敏度。由于杂交无需经过多个扩增步骤,因此与上述bDNA系统相比,杂交过程更快、更简便。此外,AMPIVIEW™探针不需要任何特殊设备,可用于手动或自动程序。
关于检测,与标准的ISH检测一样,可以是直接或间接检测。当探针用生物素标记时,可直接使用与报告酶连接的链霉亲和素(直接或一步式方案)。在间接(或两步)方案中,抗生物素或抗地gao辛抗体可和即用型POLYVIEW® PLUS AP或 HRP检测试剂结合使用,产生高强度显色,染色清晰。
图 3. AMPIVIEW™ RNA 探针设计和信号放大方式简图。
Enzo Life的第一批AMPIVIEW™ RNA探针是针对HPV的。La Rocca博士等人证明,基于LoopRNA技术的ISH探针可以检测HPV DNA和RNA,甚至可以检测到单拷贝基因组整合的HPV。这些结果与另一种市售的双Z探针进行了比较,表明AMPIVIEW™ RNA探针具有同等或更优越的性能(5)。文章还强调了LoopRNAs 的另一个相关特性,即可以合成与有义序列(与病毒基因组DNA互补)和反义序列(与基因组DNA和RNA转录本互补)相对应的探针,以便区分基因组DNA和病毒主动转录的RNA。
AMPIVIEW™ RNA探针实际上可以针对任何基因组中的任何基因进行设计。例如,在COVID-19大流行期间,俄亥俄大学的Nuovo博士使用AMPIVIEW™探针检测了COVID-19患者不同组织中SARS-CoV-2 RNA的表达,比较了病毒基因组的存在和四种特征性病毒蛋白(包膜、穗、膜和核帽)的存在(8)。 参考文献:
1.Gall JG & Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. PNAS (1969). PMID: 4895535.
2.John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature (1969). PMID: 5799530.
3.FarrellJr RE. Nucleic Acid Probe Technology. RNA Methodologies, Ch 12. (2020). Full Text.
4.Wang F et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn (2012). PMID: 22166544.
5.La Rocca G et al. Recent improvements in in situ hybridization for the detection of HPV infections in clinical samples. WCRJ (2020). Full Text.
6.Player AN et al. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J Histochem Cytochem. (2001). PMID: 11304798.
7.Atout S et al. Evaluation of the Suitability of RNAscope as a Technique to Measure Gene Expression in Clinical Diagnostics: A Systematic Review. Mol Diagn Ther (2022). PMID: 34957535.
8.Nuovo GJ et al. A Standardization Protocol for the In Situ Detection of SARS-CoV2 RNA and Proteins. Appl Immunohistochem Mol Morphol. (2022). PMID: 35175238.