走近实验技术中的“四大发明”之Southern blot、Northern blot和Western blot

笑看风云

我们经常会在科研过程中遇到各种blot技术，包括Southern blot、Northern blot、Western blot，还有不太常见的Eastern blot等等……对于blot这个大家族，初次看到，是不是已经开始犯迷糊了？其中的这四种blot技术，就像中国的四大名著、四大美女，尤其像是民国的四大家族，根据各自的“管辖范围”分成“南北西东”四个家族。今天我们就来讲讲其中三个，想知道他们都是怎么管理的吗？那就接着往下看吧！


▲各种blot技术（图片源自：Wikipedia）。
简介
Blot，即印迹实验，是生物学实验中常用的检测和分析方法，是通过“印迹转移+标记检测”的方式将待检对象找出来的技术手段。整个过程可以简单描述为将待检生物大分子经电泳等方法分离后转移并固定在如硝酸纤维素膜（NC膜）、PVDF膜或尼龙（Nylon）膜上，然后用特异性识别物质（如探针）去识别，最后经显色反应（同位素放射自显影、荧光、化学发光等）在膜上显示出结果。
其中，最早出现的是Southern blot，也就是“南方家族”，它是检测DNA的一种方法；接着是“北方家族”Northern blot，主要检测RNA；再然后是“西方家族”Western blot，主要检测蛋白质；而另一个“东方家族”Eastern blot应用的很少，属于Western blot的一种变形，用于检测蛋白质上特定的修饰基团或部位。
一、Southern blot
Southern blot即Southern印迹杂交，也是DNA印迹杂交，1975年由英国生物学家Edwin Southern创建，为了纪念该技术的诞生，所以被命名为“Southern”。Southern blot既可用于检测样品中的DNA及含量，又可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段以及验证检测片段的分子量大小，还可了解基因的状态是否有点突变、扩增重排等。
基本原理:
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，会按照碱基互补配对的原则特异性杂交形成双链。将经过限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳分离后的待测DNA样品，使之变性断裂后将其以保持各DNA片段的相对位置不变的情况转移到NC膜、尼龙膜或其他固相支持物上，将固定好的转印膜与加入的标记探针在相对严格的环境中进行杂交，只有二者之间有非常高的同源性时，才会按照碱基互补配对原则进行结合，再经过游离探针洗涤后，用放射自显影或者其它合适的技术进行检测，从而可以检测出特定DNA片段及其相对大小。
操作步骤：
DNA提取—DNA检测—制胶—琼脂糖凝胶电泳—凝胶预处理（DNA变性）—转膜—固定—探针标记—预杂交封闭—杂交—洗膜—压片—放射自显影


图1 Southern blot的操作步骤（Bhagavan NV., 2002）。
二、Northern blot
Northern blot即Northern印迹杂交，也是RNA印迹杂交，是1977年由James Alwine、David Kemp和George Stark发明的将RNA分子从胶上转印到膜上的方法，该方法可通过检测RNA的表达水平来检测基因表达。Northern blot这个名字来源于Southern blot，与Southern blot不同的是，Northern blot检测的是RNA，而Southern blot检测的是DNA；Northern blot检测的总RNA不用进行酶切，各个RNA分子单独存在，可直接用来跑电泳；Northern blot不使用碱变性，因为碱性溶液会使RNA水解，而是采用乙二醛或甲醛等进行RNA变性。
基本原理：
与Southern blot一样，Northern blot的原理也是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下，可按碱基互补配对原则形成双链，该过程具有高度特异性。将提取出的RNA样品用含甲醛的琼脂糖凝胶电泳变性分离后，不同分子质量大小的RNA分布在凝胶上，将其原位转移至固相载体（尼龙膜或硝酸纤维素膜）上，然后用特异性序列的非放射性标记的或放射性标记的探针与固相膜上的RNA进行杂交，通过显影观察条带的位置及强度，即RNA分子的大小和含量。
操作步骤：
RNA提取—制胶—电泳—转膜—固定—探针制备—探针纯化及比活性检测—预杂交—探针变性—杂交—洗膜—曝光—去除膜上探针—显影


图2 Northern blot的操作步骤（Alshammari et al., 2017）。
三、Western blot
Western blot即蛋白质印迹杂交，也称免疫印迹实验，简称WB。发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark），而1979年瑞士的Harry Towbin首次使用Western blot法检出抗原，但把它称为免疫印迹法，直到1981年Neal Burnette在他所著的Analytical Biochemistry中首次把免疫印迹法称为Western blot。WB是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，是基于抗体定性、定量检测蛋白质表达的一种经典、有效的技术方法。WB技术目前已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
基本原理：
Western blot与Southern blot、Northern blot的杂交方法相似，不同的是Western blot用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，以一抗代表“探针”，标记的二抗代表“显色”，检测蛋白质是否存在、大小和浓度。将经过SDS-PAGE分离的不同质量大小的蛋白质样品，原位转移到固相载体（PVDF膜或NC膜）上，用特异性抗体（一抗和二抗）与固相膜上的蛋白质发生抗原-抗体免疫反应，经过底物显色或显影观察，分析样品蛋白的表达情况。
操作步骤：
蛋白提取—蛋白定量—制胶—加样—SDS-PAGE电泳—转膜—封闭—抗原-抗体杂交（一抗孵育、二抗孵育）—底物显色


图3 Western blot的操作步骤（Roy et al., 2019）。
四、结语
最后敲黑板，总结一下：
表1 三种blot技术的对比


参考文献
Alshammari FH, Hye YJ, Jong HH, et al. Detection of cytosolic tRNA in mammal by Northern blot analysis. Bangladesh Journal of Pharmacology, 2017,12(3).
Bhagavan NV. Nucleic Acid Structure and Properties of DNA. Medical Biochemistry, 2002:521-543.
Roy J, Jain N, Singh G, et al. Small RNA Proteome as Disease Biomarker: An Incognito Treasure of Clinical Utility. 2019.

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/591499248