【Biorbyt实验】斑点印迹 Dot Blotting

大v

将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为“印迹技术”（Blotting）。生物大分子印迹技术发展极为迅速，已广泛应用于DNA、RNA和蛋白质的检测。

通常人们将DNA印迹技术称为Southern Blotting;
将RNA印迹技术称为Northern Blotting;
将蛋白质印迹技术称为Western Blotting，
将不经凝胶的印迹技术称为斑点印迹（Dot Blotting)。

蛋白质印迹技术（Western Blotting）从发明以来已有40余年，至今为止依然是“最传统”且“应用最广”的一种蛋白质表达水平检测技术。但是其实验步骤复杂，一次性处理样品能力有限，所得结果只能进行半定量分析，因而限制了其在高通量样本蛋白质表达水平检测中的应用。
相比于蛋白质印迹技术，斑点印迹分析法(Dot Blotting)通过简化实验流程，可以完成高通量样本蛋白质表达水平的检测，但是实验结果依然只能以“半定量”形式体现。
在斑点印迹中，要检测到的生物分子不是首先通过电泳分离出来的，而是将含有被检测分子的混合物直接点在膜上，烘烤固定。然后用核苷酸探针或抗体杂交后检测。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪。



斑点印迹 Dot Blotting一般操作步骤：
1、点样
取硝酸纤维素膜1张，裁成需要的长度，并在其上画长宽为1cm×1cm正方形小格。将不同浓度的标准品稀释液、样品、阴性对照、阳性对照，各取2ul点在膜上正方形小格里。
2、风干
将点样后的膜风干，或放在37℃恒温培养箱中烘30分钟。
3、封闭
将膜置于封闭液（5%脱脂奶粉溶于超纯水中）室温封闭1小时（也可4℃过夜封闭)。
4、一抗孵育
封闭结束弃去封闭液后，加入稀释好的一抗工作液，室温震荡孵育1小时（或4℃过夜）。
5、洗涤
去除一抗工作液，将硝酸纤维素膜用PBST或TBST缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。然后再用PBST或TBST缓冲液震荡洗涤3 次,每次5分钟。
6、二抗孵育
洗涤完成后，加入稀释好的二抗工作液，室温震荡孵育1小时。
7、洗涤
去除二抗工作液，将硝酸纤维素膜用PBST或TBST缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。然后再用PBST或TBST缓冲液震荡洗涤3 次,每次5分钟。
8、曝光
取出硝酸纤维素膜，吸水纸略吸去膜上多余溶液后，加入适量的发光检测工作液（吸取溶液A和溶液B按1: 1混匀），使膜上均匀覆盖，室温孵育1-2分钟。抖去多余的显色剂，用保鲜膜将硝酸纤维素膜覆盖，平整无气泡，并放在曝光夹上，然后取适当大小的胶片覆盖在薄膜上，关夹曝光。根据样品及标准品的亮度，确定大致曝光时间。一般情况下，如果样品亮度肉眼可见且较强，那么初次曝光时间应较短，一般选3-5秒:如果样品亮度肉眼不可见，则初次曝光时间应略长一些，一般选择1分钟。
9、显影
曝光后,取出胶片浸于显影液中,在红光下观察，直到胶片上的样品点不再变化为止(约1.5分钟)，取出胶片在水中涮洗一下(此步骤避免显影液与定影液混合,降低定影液使用效率),再放入定影液中，当胶片本底呈现蓝色透明后，即可取出胶片进行流水冲洗，洗净后晾干即可。

  Biorbyt团队可以为您提供斑点印迹实验所需的试剂，包括超过2800多种的抗体和400多种蛋白，用于支持您的研究。请说出您的需求，我们一定努力超出您的期望！

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/631820029