从零开始学PCR技术（一）：PCR技术科普

Rose

近日，拿到华大基因CEO尹烨的第二本基因科普书《生命密码2》，其中关于PCR的科普，很精彩，比纯技术文章读起来轻松许多，故摘录在此，与大家分享。

作者：尹烨
来源：《生命密码2》

让DNA分子倍增的魔法：PCR技术发明史

文/尹烨
如果你向生物、医学、法医行业的人士问上一句：“什么是PCR？”他们一定会脱口而出告诉你：PCR就是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）啊，它能不断复制DNA，让DNA分子一变二、二变四，极大地扩增它们的数量。
你不必诧异于他们对此技术的熟悉，因为PCR是他们工作中经常要用的基本技术，无论是基因编辑还是亲子鉴定、身份确认，都要跟DNA打交道，而自然状态下提取的DNA样本浓度一般都比较低，通常要通过PCR扩增后，才能用于对比、测序、转基因等后续操作。PCR技术毫无疑问是分子生物学时代最成功、最流行的技术。若不知、不会PCR，那就别在生物圈里混了。生物专业甚至流行着这样的段子：“我的愤怒被你PCR（极大扩增）了。”
虽然PCR技术的应用如此普遍，但知晓PCR技术发明历程的人可能并不多，更何况，这项发明还有一个让人大跌眼镜的灵感来源。
科学怪杰

生长在美国嬉皮士文化盛行年代的加州大学伯克利分校生物化学博士凯利·穆利斯（Kary Mullis）也沾染了放荡不羁的习性。他曾根据吸食迷幻剂（当时美国法律尚未对某些致幻剂下禁令）后的灵光乍现，写了一篇宇宙学论文，发表在著名的《自然》杂志上，在学术界少年成名。
可惜年轻的穆利斯并不满足于循规蹈矩的科研生活，毕业后跨界尝试过自由撰稿人、甜点店店员等工作，兜兜转转多年后才回归老本行，在西特斯（Cetus）生物公司担任合成部主管，负责合成寡核苷酸（小片段DNA）。1983年，结束了第三次婚姻的穆利斯和公司里的一位女生物学家坠入爱河。在他们的一次度假路上，穆利斯驾车在高速公路上飞驰，在香车佳人相伴的愉悦中，暌违多年的灵感女神再次光顾了他：他脑海中浮现出DNA双链的结构，以及让DNA片段不断自我复制的方法。
穆利斯马上意识到这个想法极有价值。趁着身边女友已经入睡，他停车把这个想法写了下来。然而，当他在公司例会阐述自己的想法时，因为在公司吊儿郎当的形象过于深入人心，大多数人都对这个“异想天开”的构思嗤之以鼻，就连一开始支持他的女友，后来也随着恋情的结束离他而去。
在事业感情双失意的低谷时期，穆利斯和几个助手共同开始PCR技术的研发。1984年11月，他成功完成了第一次PCR实验，对一个49bp的DNA片段进行了10个PCR循环的复制扩增。
“酶”女相助

PCR循环主要分三步：变性（先用高温让DNA双螺旋结构变性，使两条互补链分开变成单链），退火（降低温度使引物与单链DNA结合），延伸（DNA聚合酶以引物为开端，为单链DNA合成一条互补链，形成一条完整的新DNA）。每经历一轮循环，DNA的数量便会增加一倍。
最初，穆利斯在PCR实验中使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶，这种酶跟多数酶一样，在高温状态下会永久失活。在PCR的延伸阶段，他加入聚合酶进行DNA复制，而这些聚合酶会在下一个循环的高温变性阶段失活，所以每一轮循环都要加入新的聚合酶。当时聚合酶的价格胜过黄金，这样的消耗必然影响这项技术的普及。于是，穆利斯又有了新想法：换一种耐高温的DNA聚合酶，这种聚合酶在高温状态下也不会失活，这样整个PCR过程只需要加一次酶就够了。
那有没有这样的耐高温酶呢？还真有！美国黄石国家公园的大棱镜温泉（又名大虹彩温泉）是美国最大、世界第三大的温泉，水温高达85℃。此温泉的特异之处是，从里至外依次为蓝、绿、黄、橙、橘、红等各种颜色，像棱镜折射出来的太阳光一样五彩缤纷。
这些缤纷虹彩其实是嗜热菌的颜色。温泉里生活着大量的嗜热菌，它们在85℃以上的高温环境也能生存，而且体内富含色素，使温泉呈现出各种颜色。
1973年，科学家钱嘉韵赴美留学，她在辛辛那提大学生物系读研期间曾从大棱镜温泉的嗜热菌中提取到耐高温的DNA聚合酶。但当时PCR技术尚未发明，所以这种耐高温DNA聚合酶也没有用武之地。钱嘉韵的这个研究，在发了篇研究论文之后便被束之高阁了。
这篇多年无人问津的论文，成了启发穆利斯的灵感之光。1986年，他按钱嘉韵论文中的方法，成功提纯了耐高温DNA聚合酶，把它用于PCR，其效果让他喜出望外：这种酶不但大大减化了PCR工作流程，而且其专一性及活性比之前使用的聚合酶都更强。
穆利斯的工作受到了DNA双螺旋结构发现者之一、诺奖得主詹姆斯·沃森（James Watson）的赞赏。沃森邀请他参加冷泉港实验室的“人类分子生物学”会议，在会上报告PCR的原理及实际应用结果，这是穆利斯生平第一次受邀出席高端学术会议。
“机”友加盟

现在，PCR操作已经非常简单，加样完毕后放PCR仪里，坐等几十个循环结束，便可得到扩增出来的大量DNA。
但在穆利斯那个时代，PCR仪还没有发明出来，所以他的PCR实验需要纯手工操作：分别将3个水浴槽设置为高温变性温度、退火温度、延伸温度，然后把装着PCR管的小篮子放进高温变性水浴槽里泡着，十几秒钟后，DNA充分变性了，便把篮子放退火水浴槽里几秒钟，让引物和DNA结合，再把篮子放延伸水浴槽里几十秒合成新的DNA。一个PCR循环，就要把篮子在3个水浴槽都过上一轮。几十个循环下来，技术员已是筋疲力尽。
为了减少“生物民工”的劳动量，西特斯公司在1988年发明了第一台PCR自动化循环仪，实现了PCR技术的自动化。有了耐高温DNA聚合酶和PCR仪这两大法宝，PCR技术终于可以投入使用。1989年，《科学》杂志隆重报道了PCR技术和耐高温DNA聚合酶，西特斯公司也和罗氏（Roche）公司合作，将PCR技术用于临床诊断。1991年，罗氏公司斥资3亿美元，买下了西特斯公司的PCR技术专利。
然而，穆利斯却没有从这笔巨款中分到一杯羹。1985年，在PCR技术初见成果的时候，西特斯公司见穆利斯迟迟没有动笔把该技术写成论文投稿，便催他手下的技术员先写了论文，投给《科学》杂志。等穆利斯终于写好论文时，投稿却到处碰壁，最后，在华人生物学家吴瑞的推荐下，穆利斯的论文发表在《酶学方法》(Methods in Enzymology)杂志上。穆利斯不满被公司其他人抢了功劳，参加完沃森的“人类分子生物学”会议后不久就辞职离开，日后PCR技术专利转让带来的巨额利润也与他无缘。
好在世人并没人忘记他，不仅多家生物公司向他抛来橄榄枝，日本天皇夫妇还亲自为他授予巨奖。1993年的一个清晨，诺贝尔基金会给他打来电话，通知他获得了诺贝尔化学奖。获奖后，穆利斯出版了自传《心灵裸舞》，总算圆了自己的作家梦，并在写书期间迎娶了他的第四任妻子，成了事业爱情双丰收的人生赢家。尽情享受过人生后，74岁的穆利斯在2019年8月7日因肺炎去世。
虽然穆利斯一生放浪形骸，但他发明的PCR技术确实极大地推动了生物学的进步。成大事者不拘小节，也许正是穆利斯洒脱不羁的性格造就了他天马行空的想象力和果断的行动力，才让当时不被多数人看好的PCR技术得以问世。
参考文献

• （美）凯利·穆利斯.心灵裸舞[M]. 上海科技出版社，2006.
  
• Chien A., Edgar D.B., Trela J.M.. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaicus[J]. J Bacteriol. 1976 Sep, 127(3): 1550-7.
  
• Guyer R.L., Koshland D.E. Jr. The Molecule of the Year[J]. Science. 1989 Dec 22, 246(4937): 1543-6.
  

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