荧光原位杂交

病理医师

荧光原位杂交
一、荧光原位杂交原理
     以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号[1]。
二、荧光原位杂交探针类型

探针类型	探针简介
双链DNA探针	目前应用广泛，简便易行，不易降解，一旦克隆成功，就可运用相同的扩增和标记程序获得大量的标记探针
单链DNA（ssDNA）探针	稳定，更易于使用，更具特异性对RNase具有抗性，更好的组织渗透性，无自我杂交
RNA探针（核糖体探针）	更高的热稳定性，更好的组织穿透力，特异性更高，RNase的影响更小
合成寡核苷酸	经济、稳定、特异性强，对RNase具有抗性，组织渗透性好，重现性好

三、荧光原位杂交样本处理
（一）常规石蜡包埋组织切片
     新鲜样本取材后经过固定、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和烘烤制备成常规切片，过程中特别注意固定（固定液类型、固定时间）和切片（载玻片选择、预防脱片、切片厚度）。
1、固定：常规固定液为4%中性甲醛，凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织），于离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸泡）于装有足够量固定液的容器中固定。固定不及时，细胞发生自溶，DNA降解，DAPI下观察，标本呈现核很浅，甚至有糜烂现象，信号无或缺失严重；若固定时间太久，大分子交联情况严重，很难进行消化，背景高。如果把握不好固定的时间，对后续结果判读有很大的影响。
2、切片：一般3～5μm之间，若切片薄，所需消化时间相对短，若消化过度，信号会出现很大比例的丢失，影响结果判读；若切片厚，难于消化，需适度延长消化时间，且易出现细胞堆积层叠情况，细胞界限不清晰，不易单独计数，更易出现高背景，影响结果判读。
（二）常规细胞学样本
1、低渗：低渗处理凭借反渗透作用使细胞膨胀、染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。样本需要进行充分低渗，但是避免低渗不足或者过度。低渗是否充分对FISH检测结果影响非常明显，对于低渗不足的样本，后续可以尝试延长消化时间，改善结果，但是对于低渗严重过度的样本，FISH结果几乎不可逆。
2、预固定：低渗后细胞核膨胀，比较最脆弱，进行预固定时，小心缓慢加入固定液。卡诺氏固定液是常使用的细胞固定液，适用于一般组织和细胞的固定，有极快的渗透力，能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性。
3、滴片：质量好的细胞滴片应具备：细胞密度及数目适当，分布均匀。密度过高的滴片细胞互相重叠；密度过低的滴片，细胞量少，均难以做出准确的诊断。当遇到标本细胞严重聚集成团，细胞碎屑或杂质过多（可自发荧光，造成强背景）时，则需要低渗前使用胰酶或胶原酶进一步处理（常用于尿脱落细胞、羊水细胞），使细胞分布更均匀，滴片背景更干净。
四．荧光原位杂交优势[2]
      1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在一年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
      卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)能够提供包括从探针设计、样本处理、杂交检测、基因表达研究到数据分析等一站式FISH技术服务，实现了检测程序的规范化和标准化，提高了实验结果的准确性，降低了假阳性和假阴性，保证为客户提供高质量的FISH服务。我们的荧光试剂和探针经济安全，短时间内即可完成所需实验，可以帮助客户减少实验室FISH操作的复杂耗时过程，同时降低了实验成本，节约宝贵样本，为客户的科研工作保驾护航。
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[1] Jiang J , Gill B S , Wang G L ,et al.Metaphase and interphase fluorescence in situ hybridization mapping of the rice genome with bacterial artificial chromosomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, 92(10):4487-4491.DOI:10.1073/pnas.92.10.4487.
[2] Swidsinski A .Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Inflammatory Bowel Disease–A fluorescence in situ hybridization (FISH) study[J].Zeitschrift Für Gastroenterologie, 2006, 43(5).DOI:10.1055/s-2005-919878.

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