免疫荧光VS免疫组化

病理医师

一、石蜡切片免疫荧光
1.多聚甲醛固定组织脱水：75%酒精4h；85%酒精2h；90%酒精1.5h；95%酒精1h；无水乙醇Ⅰ0.5h；无水乙醇Ⅱ0.5h。
2.组织透明：组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂（无水乙醇：二甲苯（1：1）溶液侵泡10min；二甲苯Ⅰ侵泡10min；二甲苯Ⅱ侵泡7min；）能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
3.浸蜡：透明后的组织块依次经3缸石蜡（60℃）进行浸蜡。石蜡Ⅰ（60℃）1h，石蜡Ⅱ（60℃）1h，石蜡Ⅲ（60℃）1h。以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成。
4.包埋：包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。
5.切片和烤片：切片前先将蜡块切面在冻台上冷冻几分钟，然后将所要切的包埋块固定在标本夹上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触。右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于42℃左右水浴展片锅中，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃ 烤箱烤片3个小时即可。
6.切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。
7.抗原修复：微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯中的不锈钢切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min。到时间后将烧杯从微波炉中取出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。
8.血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。
9.一抗染色：甩去多余液体，不洗，然后滴加稀释好的一抗，4°C湿盒中孵育过夜。
10.荧光二抗染色：PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。
11.DAPI复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。
12. 用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
二、常规免疫组化
1.备片
A.5uM厚，涂有APES的胶片（防脱，或用poly-L-Lysine，多聚赖氨基酸），干燥切片，烤片，60℃，30min，至石蜡组织融化贴于玻片上；
B.二甲苯脱蜡   20minX3，至蜡消失，第一缸时间长，二三岗较快，需上下拉提，加快速度（也可每岗10min）。注：一定要趁热放如二甲苯中；
C.水化  梯度酒精水化（100%-100%-90%-80%各3min），后入自来水（最好是蒸馏水），若未洗净，片子有油腻感，洗至干净，也可上下提洗。PBS/TBE洗2-3次，各5min
2.抗原修复
根据对应使用的一抗得特殊要求，对组织切片进行预处理，常用3种修复方法。
A.微波炉抗原修复操作法
切片脱蜡至水化后，3%H2O2处理10min，蒸馏水洗2minX3次，切片放于盛有抗原的修复液（工作液）容器中，置微波炉中加热，使容器内液体温度保持在92-98℃之间，并持续10-15min，取出容器冷却20-30min（注：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白质能够恢复原有空间构型）；
B.高压锅抗原修复法（推荐）
切片脱蜡至水化，将1500-3000ml的抗原修复液（工作液）注入不锈钢压力锅中，加热至沸腾。切片至金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅慢慢喷气时（约加热5-6min后），计时1-2min，将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取下切片，静晾至室温（注：高温高压热修复法，适用于大量中性福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复，效果优于其他方法，使IHC结果更可靠）；
C.电炉煮沸抗原修复法
切片脱蜡至水化，放入盛有抗原修复液的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的器皿中，电炉中加热煮沸，从小容器温度达到92-98℃起计时15-29min，然后端离电炉，室温冷却20-30min，蒸馏水冲洗，PBS冲洗。
3.免疫组化染色
A.抗原修复完成后，置于2-3次，各5min；
B.加入100ul A液（过氧化氢），孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性染色（本步骤也可用30%H2O2，现配现用）；
C.PBS洗2-3次，各5min；
D.加入100ul B液（超级封闭液），孵育5min，减少非特异性染色（注：此步骤不要超过10min，若一抗在含5%至10%正常山羊血清的缓冲液中稀释，此步骤可省略）；
E.PBS洗2-3次，各5min；
F.加一抗，室温或37℃孵育20min；
G.PBS洗2-3次，各5min；
H.加入100ul C液（一抗放大液），孵育10min；
I.PBS洗2-3次，各5min；
J.加入100ul D液（酶标二抗聚合物），孵育10min（注：此液对光敏感，需要避光）；
K.PBS洗2-3次，各5min；
L.配制新鲜底物液：将30ul F液（DAB B液）及1ml的E液（DAB A液）充分混合，即配制成新鲜底物液（该底物液可存放2周）；
M.加入100ul 新鲜底物液，孵育5min;
N.自来水冲洗几遍后，放入蒸馏水中，建议显微镜下观察；
O.复染苏木素染色1min，自来水冲洗2遍，盐的酒精分化（上下提拉几次），自来水冲洗2遍。氨水返蓝，自来水冲洗2遍。目的是为了更好地定位目标抗原的位置，不复染很难确认其在胞液还是胞浆；
P.75%-95%-100%-100%乙醇-二甲苯2-二甲苯1，每缸1min左右；
Q.二甲苯1min，干后封片
三、两者的异同点



免疫荧光与免疫组化的异同

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/660080116