免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)区别

笑看风云

什么是免疫组化（IHC），免疫细胞（ICC），免疫荧光（IF）?
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫荧光（IF）是一种用于检测以及识别细胞和组织中蛋白质和其他分子的亚细胞分布和迁移的强大检测技术。IF可用作免疫组织化学 (IHC) 或免疫细胞化学 (ICC) 中使用的传统显色标记的替代物。通过使用多种标记物的二级抗体，可以研究感兴趣蛋白的共定位，这是不能通过常规IHC或ICC实现。这是同时分析许多目标蛋白时的一个优势，可同时生成大量亚细胞定位的准确数据。
IHC和ICC使用的样本类型不同。IHC利用通常冷冻或石蜡包埋的整个组织样本。ICC指的是分离的或培养的细胞样本。这两种样本类型都可以使用IF进行标记检测。直接法IF使用带有偶联荧光染料（共轭抗体）的一级抗体。间接法IF需同时使用可结合靶标抗原一抗和偶联荧光染色的二抗。



你是否曾经被选择IHC、ICC和IF所困扰？
在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry(ICC)，免疫荧光 Immunofluorescence (IF)。
从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。因此，才会延伸出三个相近的概念。这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。而常用的方法就是化学显色和荧光显色。如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。




A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（10001-R043-50）—人胎盘
B 免疫细胞化学：兔α微管蛋白单克隆抗体抗—MEF1细胞
C免疫荧光组织：兔Cdk5单克隆抗体—鸡脑组织
D免疫荧光细胞：兔JNK2/MAPK9（10745-R004-50）单克隆抗体—人Hela细胞
A图和B图是免疫化学（Immunochemistry），这种应用是抗体检测目标蛋白，发生了化学反应，然后显色，根据样本类型的不同，又可以分为免疫组织化学（A）和免疫细胞化学（B）。
C图和D图是免疫荧光（Immunofluorescence），这种应用根据抗体检测目标蛋白然后通过偶联荧光基团来显色。根据样本类型的不同可以分为免疫荧光组织（C）和免疫荧光细胞（D）
这几种技术如何选择？
免疫组化实验：
标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织切片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

抗体：免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

常用染色方法：根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。
免疫荧光实验：
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

原理：免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。
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