免疫荧光同源双标染色实验

莺歌燕舞

公司提供疾病模型平台，药效药代毒理实验，各类指标检测以及细胞系动物基因编辑平台，可为科研机构和新药研发企业提供专业的产品及服务，自用实验动物房，专业百级净化动物供应商。
1  技术原理介绍
主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA是一种基于辣根过氧化物酶HRP的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。技术主要原理为荧光标记的酪胺在HRP与H2O2的作用下变为活化的酪胺，附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上。
2.1 实验器材

3  实验步骤
3.1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。
3.2抗原修复：修复条件详见上表。修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。修复完成，自然冷却。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3.3画圈：双氧水封闭组化笔在组织周围画圈，切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min
3.4血清封闭: 甩干PBS, 滴加BSA（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭），封闭30min。
3.5加第一种一抗：去掉封闭液，滴加配好的一抗，平放于湿盒内4°C孵育过夜。
3.6加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加对应的HRP标记的二抗，室温孵育50min。
3.7加对应的tsa染料：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。
3.8微波处理：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内加热处理（修复液种类同第一次的修复液保持一致），中火8min停火8min转中低火7min。
3.9加第二种一抗：滴加配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
3.10加对应的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加对应的荧光二抗，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。
3.11DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
3.12自发荧光淬灭：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂B液，孵育5min，流水冲洗10min。（如果客户需要观察组织自带荧光，则将该步骤去除）
3.13封片：抗荧光淬灭封片剂封片。
3.14采集图像:DAPI激发波长330-380nm，发射波长420nm；488激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3激发波长510-560 nm，发射波长590nm；CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712 nm。


4   结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色，488通道阳性为绿色，CY3通道阳性为红色，CY5通道阳性为粉色。
<hr/>公司提供疾病模型平台，药效药代毒理实验，各类指标检测以及细胞系动物基因编辑平台，可为科研机构和新药研发企业提供专业的产品及服务，自用实验动物房，专业百级净化动物供应商。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/695456935