细胞培养的整个过程都是怎么回事？有没有大神给全面讲讲？

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细胞培养的整个过程都是怎么回事？有没有大神给全面讲讲？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/549424018

大力水手

平时研究用的细胞，需要冷冻保存。冷冻的过程称为冻存，和冻存对应的过程，称为复苏，通俗地说就是把冻上的细胞化开。
细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。
下面小编就和大家分享细胞复苏的“避坑指南”。
细胞复苏的基本原则

快速融化：细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
在复苏时，需要快速升温，在 1-2 min 内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。
避免温度变化：在复苏过程中，应尽量避免温度的剧烈变化，以免对细胞造成额外的压力。


细胞复苏的实验步骤及注意事项

(1)提前从液氮罐中取出需要解冻的冻存管，放于-80 ℃冰箱(为了避免解冻时冻存管中的气温急剧上升，温差过大导致的爆炸)，让冻存管中的液氮挥发。
注意：从液氮中冻存细胞时，要佩戴护目镜和防冻手套，谨防冻伤及冻存管爆炸!
(2)冻存管取出后，以最快速度放入37℃恒温水浴锅中。如果储存装置和解冻装置相隔较远，可使用装有干冰的隔热容器临时保存和运送细胞。
细胞放入水浴中复苏时，注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以可以避免复苏过程中细胞液中有冰晶的出现。快速升温可以使冰晶迅速融化，避免伤害细胞，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
另外，冻存管管口不能接触到水浴锅里的液体，避免造成污染。水浴锅中的无菌水也要定期更换。
什么时候停止解冻?

通常建议冻存管融化至只剩约2毫米直径的冰晶时，即可停止水浴，继续晃动至冰晶融化。此时复苏的时间刚好，避免复苏过头。(升温至室温或更高温度会增加冷冻保护剂的细胞毒性，这会极大影响细胞活力。)
(3)完全融化后，马上擦干并用75%酒精擦拭冷冻管外部进行消毒。然后在无菌环境下，用移液管吸取5ml预热的完全培养基加入15mL无菌离心管中，再吸取冻存管里的细胞悬液加入离心管中。
注意：
◆ 解冻后应尽快稀释，以减少 DMSO 的细胞毒性。
◆ 此时细胞比较脆弱，细胞膜表面还未完全恢复，剧烈的吹打会造成细胞活率下降。因此，需要以轻柔的方式稀释细胞冻存悬液。轻柔颠倒混匀，充分稀释冻存液，有条件可以静置1分钟，使细胞恢复渗透压，再进行下一步操作。
(4)根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，吸掉上清液，加入2-3mL预热的完全培养基，用移液管轻轻吹打均匀，保证细胞完全重悬。
注意：离心的目的有两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转速不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转速过高活细胞受压过大，会导致死亡。推荐250 g离心4 min。
(5)吹打好后，用完全培养基适当稀释，然后将重悬的细胞全部移入新的培养皿或者培养瓶中摇晃均匀。
(6)最后放入37℃恒温细胞培养箱，依据细胞状态，在细胞贴壁后或 24 h 后，更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。
注意：细胞复苏的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。


常见的问题

(1)细胞复苏后，细胞数量很少

可能原因：细胞冻存前活细胞少，状态不佳;细胞解冻速度过慢;细胞冻存悬液在常温下时间太久;未充分稀释冻存液;离心速度不恰当。
对策：
◆ 确保冻存前细胞状态良好，活细胞比例高。
◆ 加快解冻速度，尽量减少在常温下的放置时间。
◆ 确保冻存液充分稀释，避免对细胞造成损伤。
◆ 调整离心速度，找到最适合细胞的离心条件。
(2)细胞复苏后，很多难以贴壁

对策：
◆ 检查缓冻快融操作是否规范，避免操作不当导致的损伤。
◆ 确认冻存前细胞的密度和活率是否适宜。
◆ 控制好消化时间，避免过长导致细胞贴壁能力下降。
(3)细胞贴壁了，却长不起来

对策：
◆ 调整细胞密度，尝试将细胞转移到较小的培养器皿中，促进细胞间的相互作用。
◆ 给予细胞足够的时间来适应培养环境，有些细胞复苏后需要一段时间才能开始生长。
◆ 确保冻存前细胞状态良好，避免冻存前细胞已处于凋亡状态。
此外，还需注意培养环境的无菌操作，定期检查培养基的成分和pH值，以及确保足够的营养供给和适宜的气体环境(如CO2浓度)。在处理细胞时，温和操作，避免造成机械损伤。
细胞培养是一门实践性很强的技术，需要在实践中不断学习和总结经验，希望这些建议对您有所帮助。

检验医师

细胞培养相关实验有细胞复苏，细胞冻存，细胞传代，细胞铺板，细胞给药，细胞cck8实验，细胞培养上清液获取，细胞蛋白提取，细胞内各种因子测定等等等等。
一时半会是说不完的，那么就细胞单纯培养说一说吧。
细胞大部分人都是购买的冻存细胞或者复苏好的37摄氏度培养的细胞，个别是自己从动物或者人体组织里面消解获取得到的细胞。
细胞一般有两种培养基，一种是DMEM，一种是1640培养基，购买来的培养基一般不能直接使用，需要加入1%的双抗，以及10%的FBS，双抗是为了抗菌，FBS是牛血清蛋白为细胞提供营养物质。
细胞培养是在培养皿，培养瓶里面进行的，贴壁细胞会吸附在培养皿的底部，悬浮细胞顾名思义大部分悬浮在培养基中，一部分会重力沉淀在底部，但是几乎不吸附不贴在皿的底部，轻轻一晃就会悬浮。
再说说细胞换液，换液就是原有培养基里面的营养物质被细胞吃掉了吸收的差不多了，这个时候培养基一般会泛黄，就需要更换新的培养基，对于贴壁细胞，只要把上清液倒掉，用PBS轻轻在表面流过洗一下，就可以重新加入新的培养基，注意培养基加入的时候，不能直直的冲打有细胞的皿底部，而是要打在皿的侧壁使培养基慢慢滑下去。对于悬浮细胞可以将细胞悬液吸到离心管中，离心后去掉旧的上清培养基，加入新的培养基重悬后加到皿里，也可以采取半换液方式，比如一皿细胞分到两皿中，然后再在隔皿中加入新的培养基，这不仅仅是换液，也是传代了，一皿变两皿。
关于细胞传代，悬浮细胞就是上述操作，贴壁细胞相较于悬浮细胞则要繁琐一点，当贴壁细胞在皿底部长满以后，需要倒掉上清液，PBS清洗，倒掉PBS，加入1-2ml的胰酶，此时胰酶会将细胞之间的黏连蛋白消化掉，使得细胞变成单细胞，并且很容易将细胞从皿底吹打下来，胰酶消化时间到了，需要加入两倍胰酶量的培养基终止消化，这样不至于细胞膜被消解掉损伤细胞，然后不断的冲洗皿底，将细胞吹打下来后，吸入到离心管中离心，去掉上清，加入新的培养基重悬，按照传代密度分别放入皿中即可。
就此！细胞培养其他操作可以参考我之前的文章。
实验室技能：细胞培养相关知识及技术操作
实验室技能：细胞复苏
实验室技能：细胞换液/传代/铺板
每天一个实验室小技巧：细胞计数
实验室技能：CCK8测定药物毒性
每天一个实验室小技巧:细胞传代以上就是了。如有疑问评论区留言。

大力水手

细胞是生物学实验的重要材料，也是生物细胞学实验的基础，药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。而细胞培养，受人员操作和环境条件的影响比较大，在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题，而每个问题都有可能导致细胞培养的失败。我们汇总了细胞实验室多年来的细胞培养经验分享给大家，希望能给大家的细胞培养带来帮助。

一．细胞系身份需明确
我们之所以选定某种细胞系开展实验，是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性，疾病特性，功能特性，基因表达特性等。一旦用错了细胞株，对我们研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。
而近年来，多个权威机构发现细胞系在培养和流通过程中，出现了很严重的交叉污染。据不完全统计，单就HeLa细胞系导致的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个权威机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞完全吸收，在所检测细胞中污染占比46%，可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此，做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株，最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。
目前，STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一，是ATCC等权威机构认定的金标准。不过可惜的是并非所有细胞均可进行STR鉴定，目前只有大部分的人源细胞株和45个种类的小鼠细胞株可以进行鉴定。其他细胞株可以结合细胞形态、特性和物种鉴定来进行确认。
二．培养、传代、冻存和复苏

1.准备工作：
根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件，以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。
2.贴壁细胞传代：



1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）
2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）
3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。
4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。

PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。
5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。
6）加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。
7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。
3.悬浮细胞传代：



因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。
1）直接传代时，静置5-10分钟，待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培养液，补足新鲜的含血清完全培养液，混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，轻轻摇晃混匀。
2）离心传代时，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。
3）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
4.贴壁悬浮混合型细胞传代：


先将悬浮的细胞收集，再参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集，一起接种到培养器皿中。
PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高，培养中最好参考指南控制好细胞密度，不能过密也不能过稀。
5.细胞冻存：
1）按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。
2）加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的完全培养液），使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml，移入细胞冻存管中。
3）程序降温（以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例）：4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）
6.细胞复苏：
1）取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（通常2min内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。
PS：干冰运输的冻存细胞，收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。
2）转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。
3）将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清完全培养液离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清。
4）重新加入经预热的含血清完全培养液重悬细胞，以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。
5）放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
三.污染防治
1.细菌污染
细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。



左边的就是比较典型的杆菌污染，一般杆菌会延轴向快速游动，量少时培养基澄清。右图是颗粒状污染，一般培养基会浑浊或有白色沙状沉淀。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h内即可使培养基浑浊；厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢，需要较长时间才会观察到浑浊现象。
污染处理：由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥，所以出现污染后加双抗（青霉素&链霉素，Penicillin + Streptomycin）一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周，效果相对还不错。
2. 真菌污染
细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左边这张是比较典型的霉菌污染的图片，右图是酵母污染，镜下可以看到明显的出芽形态。


污染处理：可用100ug两性霉素B/T25瓶，处理一周。
注：两性霉素毒性较大，需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。
3.支原体污染
支原体的危害：支原体污染可以改变细胞的特性。例如部分支原体会快速消耗培养液中的精氨酸，与细胞竞争营养，从而使细胞的生长速度减慢或停止；同时支原体还可以改变细胞的酶谱、细胞膜成分，造成细胞染色体异常或细胞病理性改变等。上述情况会严重影响到使用这些细胞所做实验的结果，导致结论不可靠。



（PCR法检测细胞上清中的支原体污染）

支原体的预防与清除：由于支原体无法在镜下直接看到，需要通过PCR法等进行检测才发现，出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检，做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检，直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理，优先处理“支原体阴性”细胞，后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。同时，新引进的细胞系都进行支原体检测，确保不给实验室带来新的污染。
4.实验室细胞污染防治
建立良好的规章制度对减少细胞污染会有很大的帮助。包括准入制度、操作规范和日常管理制度。
准入制度：包括了人员的和物料的。人员需要进行培训之后才能自己进行操作，而且要符合穿戴要求才能进实验室，如白大褂、隔离服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品应严格消毒灭菌，而购买的物品需要从正规的、可靠的渠道购买。新买的细胞应检测验证后再使用。
操作规范：对于常规操作最好制定规范，且实验室人员都要按操作规范进行，不能随意更改，同时也是培养实验人员的良好操作习惯。比如，枪头滴管吸完就不再二次伸入培养基中吸取，一次吸够足够量的培养基。加液时也应尽量做到悬空加液，这些都可有效预防支原体污染和细胞交叉污染。另外可以的话，一次只操作一株细胞，细胞与细胞间最好有一点时间间隔，避免交叉污染。
日常管理制度：则包括环境及耗材试剂等的使用、清洁、保养等各方面的规则、方法。还有试剂耗材等的用量、库存及采购等的管理，包括细胞样品的两级库存管理。对于不易发现的污染源，最好定期进行检测，主要是支原体污染和细胞交叉污染。
四.细胞培养常见问题汇总
新买或惠赠的细胞
1.新买的或惠赠的细胞如何处理？
不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手应赶紧做这几件事：检测瓶子是否破裂；培养基是否漏出，是否浑浊；是否有支原体污染；迅速扩增冻存。
2.能否使用与原先培养条件不同的培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
3.购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？
常见原因可能有：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；培养箱气体浓度达不到要求；细胞置于 –80 ℃ 太久。
复苏冻存的细胞
4.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
5.冷冻管应如何解冻？
将冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？
现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO除去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
细胞培养用液
7.如何正确选择培养基种类？
引用几款比较经典的培养基举例：


8.如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首选 MEM 做粘附细胞培养，RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始。
9.什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
10.细胞培养基的配制和储存应该注意什么？
细胞培养基配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃培养箱内放置24~48h，已检测培养液是否有污染，然后方可用于实验。配置培养基所需的血清要合格并且保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整pH值较容易。每次配液量以使用两周左右的量为宜，一次配液不要太多，一是短期内用不完造成营养成分损失需要补充，二是量大易造成污染。
11.为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏紫色？
培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，培养基内的 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂 （通常为 phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏紫色。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2，以调整 pH 值。
12.什么情况下用到无血清培养基？
对于应用培养细胞进行分离制备细胞生长因子、单克隆抗体等应该选择无血清培养基。
13.如何选择正确的血清种类？


14.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
15.血清灭活是否必须？
一般情况下不建议。热灭活是以 56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有：溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多， 这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是 "小黑点"，常常会让研究者 误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37C 环境中，又会使此沉淀 物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。因此除了做免疫学相关实验和培养一些特定细胞，如平滑肌细胞、胚胎干细胞等，不需要做热灭活处理。
16.培养基中是否添加抗生素？
除特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
17.何时更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。
细胞传代
18.细胞传代的方法都有哪些？
根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
19.原代培养的首次传代应注意的问题？
细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代；原代培养时细胞多为混杂生长，不同的细胞有不同的消化时间，因此要根据需要注意观察及时处理，并根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间而分离和纯化所需要的细胞；
吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤；首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增值；随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。
20.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？应如何处理？
EDTA作用较胰蛋白酶缓和，主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。常用比例为1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在终止消化前，需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成胰蛋白酶的活性降低，并可减少污染的机会。
21.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为800~1000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。
22.细胞的接种密度为何？
依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。
23.细胞交叉污染的可能原因？
多种细胞系进行维持传代操作时，各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。
细胞冻存


24.冷冻培养基为什么要加DMSO？
因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将造成细胞损伤，还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高包膜对水的通透性。
25.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？
冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。
26.欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
27.冷冻保存细胞的方法？
冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 长期储存。
冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
28.细胞冻存太多会不会浪费？
每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止由于细胞污染等因素造成的细胞系的绝种，而且每一批次培养的细胞状态都不同，应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或者发生改变。

大力水手

细胞培养是生命科学研究、临床研究、药物发现和开发，以及治疗药物生产等诸多领域的关键方法。培养细胞需要无菌环境、营养物供应及维持理想生长条件的专用操作技术。更多细胞培养内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn

感恩由您

对于完整的细胞培养体系而言，细胞培养包括前期的细胞培养室的搭建、细胞培养环境的清洁和消毒、细胞的准备、细胞培养基的制备、耗材的准备、实验操作、数据分析等。

单纯从实验操作一方面来说：包括细胞的复苏、细胞的传代、细胞的冻存。
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 × g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。


细胞解冻流程图
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
什么是细胞传代？
细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程被称之为细胞传代培养。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
耗材准备
在实验开始前，需要把实验用品准备齐全。
酒精、预热好的完全培养基、PBS缓冲液、胰酶、培养瓶或培养皿、移液器、移液管、离心管等
实验用的超净工作台需提前半小时照射紫外线。
实验操作
以贴壁细胞培养为例
1、穿好细胞房专用的实验服，戴好灭菌手套和口罩。
2、从培养箱中取出细胞培养瓶或培养皿（Tip1：一般选择处于对数期的细胞），用75%酒精消毒外包装后转移至到超净台中。
3、打开盖子（Tip2：如果是培养皿，只需打开一个缝隙即可，避免污染），轻轻吸出旧的培养液，加入适量PBS缓冲液洗涤1-2次（Tip3：注意从未培养细胞的侧壁加入，以免冲掉细胞），弃去PBS缓冲液。
4、用移液器加入适量胰酶（Tip4：具体量根据实验需要确定，提前将胰酶37℃预热，效果更好），盖好盖子，“十字”晃动，使胰酶充分接触细胞。
5、将加入胰酶的细胞培养瓶转移到倒置显微镜载物台，镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆且大量脱落时，准备终止消化（Tip5：若初始的细胞密度比较高，加入胰酶后，肉眼也可观察到细胞脱落，当细胞有一半左右脱落时，即可终止消化，避免反复将培养皿拿出超净台，避免增加污染的风险），用75%的酒精喷洒培养瓶表面，转移到超净台。
6、用移液器加入等量含血清培养基，终止消化。移液器充分且柔和地吹打，避免产生气泡，使细胞完全脱落。
7、将培养瓶或培养皿中混合液体转移至离心管中（离心管规格根据实验需要确定），配平后离心3-5分钟左右（离心机转速根据细胞种类而定，常见的有1000-3000rpm/min）。
8、离心好后，用酒精喷壶喷洒离心管表面，转移进超净台，打开盖子，将上清液倒入废液缸。
9、加入适量体积含血清培养基，用移液器或巴氏吸管轻轻吹打，制成细胞悬液。
10、将细胞悬液分装进2个（或多个）洁净灭菌培养瓶或培养皿中，加入适量培养基，盖好盖子。
11、将分装好的培养瓶置于倒置显微镜载物台，观察细胞情况，细胞应保证一定数量，数量太少会影响生长情况。
12、在培养瓶上做标记，注明传代时间，细胞种类，操作人员等信息。在放入培养箱之前应再次用酒精喷一喷培养瓶表面，然后应记得整理操作台，用75%酒精擦拭超净台台面，清理废液和垃圾。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。
既可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，又起到了细胞保种的作用。
在不附加任何保护剂下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
因此，冻存时，应向培养液中加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞。贮存在液氮中能减少冰晶的形成。
实验开始前，要先做好准备工作：
将冻存管、离心管、移液管、移液器等耗材准备齐全，放入超净台中，打开紫外线照射 30 分钟。打开通风机通风 3 分钟。用 75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。
将离心机调节至所需转速，细胞完全培养基、DMSO、胰酶等放于37℃水浴箱中预热。
冻存步骤：
1、取出细胞，酒精消毒，放入超净台。
Tip1：应在细胞生长良好、致密度约为 80-90％，活力达 90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。
2、配置细胞冻存液：按无血清培养基：血清 ：DMSO=7:2:1 的比例配置细胞冻存液。
Tip2：DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色，可以用 0.22 微米滤膜过滤，或者直接购买无菌产品。以 5-10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
Tip3：因DMSO 本身就有灭菌的作用，因此使用前不需要进行高压灭菌。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保存效果。
Tip4：在常温下，DMSO 对人体有害，应注意生物安全防护。
Tip5：冻存液应该提前配制，防止临时配制产生的热量损伤细胞。
Tip6：加大冻存液中血清的比例对于保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处的。
3、按照细胞传代步骤，对细胞进行消化、解离。
4、消化好的细胞离心后，弃掉上清液，用冻存液重悬。
Tip7：用移液器吸去上清液时，不要吸到底部的细胞沉淀。
Tip8：用移液器轻柔吹打细胞，避免损伤细胞。
Tip9：混匀 DMSO 要快，因为 DMSO 对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。
5、可用细胞计数板或计数仪器对细胞进行计数，将细胞总数调节至细胞数量为5×10⁵个/ml为宜。
6、将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般2ml冻存管装入 1 -1.5 ml细胞冻存悬液为宜。
7、放入专业的细胞冻存盒中，或者按照：
﹣4 ℃ 30 分钟→-20 ℃ 30 分钟→﹣80 ℃过夜→液氮保存的顺序进行冻存。
Tip10：复苏遵循快速解冻的原则，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。而细胞冻存则要缓慢冷冻，目的是使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶从而降低对细胞的伤害。
对于大多数细胞来说，每分钟降 1-3℃是合适的。