【实验笔记】CRISPR 操作基础

风云

1.  基本知识

CRISPR： Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

2.  查找基因信息

查找基因信息不是步骤上简单，需要对要研究的基因有诸多的了解，如，基因是位于常染色体或性染色体、细胞类型是正常细胞或肿瘤细胞，后者是多倍体等情况

• NCBI, gene
  

NCBI 首页

2. 查找基因名称


3. 点击 ensemble，即可进行下一步分析了


3. 选择敲除区域

在 ensemble 网站上可以看到该基因很多信息，可以根据具体需要进程查阅。


选择敲除区域的原则

1. 对于蛋白功能丧失，需要尽可能多个编码转录本（外显子区域），以防止生成短截距但有活性的多肽。
2. 敲除的外显子部分，避免 3 的整数倍，造成移码突变最好。
3. 为保证敲除效率，敲除片段≤10kbp。
4. 敲除区域最好在编码区前 50%或 30%。
5. 一般不建议直接敲除 ATG所在外现在，以避免转录酶在下一个 ATG 处转录。
4. 设计 gRNA

网址：CRISPOR
gRNA 的设计原则：
① gRNA 特异性＞70 分
② 切割型＞40 分
③ 避免多个单个碱基连续，如 5 个以上 T
④ 可以设计多个 gRNA 同时实验，选择使用效果最佳的 gRNA
⑤ 可以在多个软件/网站上 对设计的序列进行评分，所有网站评分最高的往往效果较好。

5. 实验部分

5.1 载体的分类

addgene 有很多载体，一下是简要说明



载体有 2 个启动子，一个是 RNA 表达（U6 启动子），一个是 Cas9 表达（EFα启动子)；
两种启动子之后都有 BsMB1 克隆位点（无 CIP脱磷酸处理液不会自连）；
Cas9 后有 FLAG 标签，可以进行 WB、免疫染色等实验；
质粒本身有puromycin（嘌呤霉素）抗性，可以进行富集、转染、感染成功的细胞。
5.2 载体的选择

a. 单载体系统：单基因敲除
b. 多基因敲除：先构建Cas 稳定菌株，在转入目的基因的 gRNA
c. 单载体系统升级：双 gRNA 载体（具有 2 个 gRNA 表达框），

具有以下优势：
1. 提高单个基因编辑效率
2. 可以针对 2 个靶基因进行编辑
3. 可以进行非编码区基因的大片段敲除吗，如 lncRNA

- 双 gRNA 合成可以直接合成（U6+gRNA1+scaffold+U6+gRNA2 )、中间载体合成（gRNA1 正向引物+gRNA2 反向引物）
5.3 克隆方法

方法：传统克隆与 Gibson Assembly 方法（一次性可插入多个片段）
线性化：酶切法、PCR方法

6. 脱靶分析

分析网址：CRISPR/Cas9 target online predictor

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/661011460