CRISPR/Cas9系统中的crRNA和tracrRNA是什么？

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CRISPR/Cas9系统中的crRNA和tracrRNA是什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/346311185

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JIPB：利用CRISPR/Cas12i3培育香气浓郁的大豆｜基因编辑
PBJ：高效植物线粒体基因编辑工具实现CMS材料育性恢复｜基因编辑
Nat Comm：酵母中高碳生产3-羟基丙合成多种生物制品｜合成生物
SciEngine：微生物细胞工厂应用发展｜微生物
Nature Plants：“水稻癌症”新型杀菌剂｜生物农药

01 科｜技｜突｜破
JIPB：利用CRISPR/Cas12i3培育香气浓郁的大豆｜基因编辑
大豆在全球食品生产中占据重要地位，特别是作为豆乳的原料。然而，大豆的香味，特别是其独特的“稻花香”，对消费者选择大豆产品有很大影响。朱健康院士团队利用CRISPR/Cas12i3基因编辑技术，针对大豆中的两个甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因GmBADH1和GmBADH2进行定向编辑，创造出香气浓郁的大豆。研究发现，2-乙酰基-1-吡咯啉(2-AP)是产生“稻花香”味的关键化合物。通过敲除GmBADH1和GmBADH2基因，研究人员获得了gmbadh1、gmbadh2及gmbadh1/2三种类型的突变体，其中gmbadh1/2双突变体的叶片和种子展现出强烈的“稻花香”。相比之下，gmbadh2单突变体的香味较为淡雅，而gmbad1单突和野生型几乎没有检测到“稻花香”。本研究首次展示了通过CRISPR/Cas12i3技术定向改良，成功培育出适用于加工植物奶且香气浓郁的大豆。这种大豆能制作出香味更加浓郁的豆乳，提升了消费者的感官体验，预示着基因编辑技术在农作物品质改良方面的巨大潜力。
原文链接：
https://doi.org/10.1111/jipb.13631

PBJ：高效植物线粒体基因编辑工具实现CMS材料育性恢复｜基因编辑
细胞质雄性不育（CMS）问题对农业生产具有重要影响，特别是在利用CMS进行杂交种子生产的作物，如水稻中。这一问题的解决对提升作物产量具有极大意义。中国农科院深圳基因组所武志强研究团队、华中农业大学金双侠教授及日本东京大学有村慎一教授利用mitoTALENs技术对CMS-WA型水稻的线粒体内WA352基因进行精确编辑，从而恢复了这一系列不育系水稻的花粉育性及其结实能力，直接证明了WA352基因是造成CMS-WA型水稻细胞质雄性不育的原因 。通过农杆菌介导的遗传转化和组织培养，研究团队首次获得了WA352的缺失突变体，并通过PCR检测与PacBio HiFi测序数据分析确认了编辑成功。进一步的分析揭示了不同编辑结果的重组机制，进而通过花粉染色和结实率统计确认了育性的恢复，并在T1代植株中得到稳定遗传。这项研究不仅证实了mitoTALENs技术在植物线粒体基因编辑上的有效性，而且在理解和解决CMS问题、促进农作物细胞器基因编辑育种方面开辟了新的研究方向，为未来作物改良和农业持续发展奠定了坚实的基础。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.14315

Nat Comm：酵母中高碳生产3-羟基丙合成多种生物制品｜合成生物
3-羟基丙酸（3-HP）是一个具有重要潜力的生物基平台化合物，可用来合成多种商业化产品，尤其是通过脱水反应可制成丙烯酸酯。北化工研究团队通过增强细胞内 CO₂的固定和转化，成功实现了在酵母中高效生产3-HP，接近其最大理论产量。以往3-HP生产的瓶颈主要是由于细胞内碳酸氢盐供应不足，限制了3-HP的产量。通过引入碳酸氢盐转运蛋白Sul1、进行丙二酰辅酶 A 还原酶结构域的改造、删除能降解3-HP的Uga1 基因等多种策略，研究团队显著提高3-HP的产量，从摇瓶中的0.14 g/L增至11.25 g/L。此外，研究人员利用Yeast8模型进行的产能分析表明，高碳酸氢盐通量是实现高效 3-HP 产量的关键。通过对酵母细胞的精确代谢工程调控，成功大幅提升了3-HP的产量，接近最大理论产量，此研究不仅突破了以往生产3-HP的限制，还为利用 CO₂ 作为唯一碳源进行高效生物制造提供了新策略，对促进碳循环经济和实现更加绿色的化工生产过程具有重要意义。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-45557-9

SciEngine：微生物细胞工厂应用发展｜微生物
微生物细胞工厂作为合成生物学的关键研究方向之一，对于补充不可再生资源、解决资源和环境问题提供了重要解决方案。研究团队以微生物细胞工厂的产业应用为牵引，从物质代谢和能量代谢两方面系统探讨了细胞工厂的合成代谢调控机制。在物质代谢领域，通过新酶元件挖掘技术平台建立，解析了数个三萜化合物的合成途径，并开发了多基因文库调控、GBE等精准调控技术以解决适配问题。在能量代谢领域，则创新了四种葡萄糖新型能量代谢模式，有效解决了合成途径还原力供给与需求不平衡的问题。成功构建了多个化学品的微生物细胞工厂。研究不仅证明了微生物细胞工厂在实际产业中的应用潜力，也展示了合成生物学在促进资源环境可持续发展方面的重要价值。
原文链接：
https://doi.org/10.1360/TB-2022-1106

Nature Plants：“水稻癌症”新型杀菌剂｜生物农药
稻瘟病是一种严重的农作物病害，导致我国每年高达30亿公斤的粮食损失。为了解决这一农业问题，南京农业大学张正光和上海师范大学邢维满教授团队成功发现了稻瘟病菌特有的毒性效应子MoErs1，并基于此效应子设计出了一种新型的二苯醚酯类化合物FY21001，对稻瘟病具有显著的防效。研究团队发现MoErs1效应子在病菌侵染过程中的关键作用，解析了该效应子的三维结构，发现其能抑制水稻的半胱氨酸蛋白酶OsRD21，干扰OsRD21在水稻免疫中的作用。基于对MoErs1的深入理解，设计出二苯醚酯类化合物FY21001, 通过与MoErs1特异性结合，抑制其靶向水稻的OsRD21，从而有效防控稻瘟病。本研究是国内外首次提出以稻瘟病保守效应子为靶标创制杀菌剂的新理念，突破了传统杀菌剂创制的局限性，提供了控制稻瘟病的新策略，还为深入理解植物与微生物互作、探索防控植物病害的新策略提供了重要启示。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41477-024-01642-x
<hr/>知耕（TechCube）是一家聚焦生物科技领域的技术商业化创新平台；
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长长的路

CRISPR/Cas9是细菌和古生菌的一种抵御外来核酸物质入侵的防御系统，现被开发用来作为一种对特定靶序列进行基因编辑的技术。CRISPR/Cas9系统包含2个组件，一个是Cas蛋白，一个是sgRNA。sgRNA由crRNA和tracrRNA组成（图1）。每种Cas蛋白具有自己特异性识别的PAM，所以在设计sgRNA之前应确定所用种属Cas蛋白的PAM序列，例如来源于S. pyogenes（化脓链球菌）的SpCas9识别PAM是NGG，舒桐科技自主研发的来源于Faecalibaculum rodentium（啮齿粪杆菌）的FrCas9识别NRTA 。sgRNA是影响基因编辑安全性和有效性的重要因素。因此，合理的选择和设计sgRNA是进行有效基因编辑的前提。



图1 CRISPR/Cas9工作原理

sgRNA的设计原则

（1）sgRNA的长度：SpCas9的最佳sgRNA长度为20 nt，FrCas9的最佳sgRNA长度为22 nt；
（2）sgRNA的碱基组成：sgRNA的序列应避免出现TTTT终止信号，GC%含量最佳为40%-60%；
（3）如果构建T7/U6启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基最好为G，或人为添加一个G来提高其转录效率；
（4）避免选用在基因组上比对到多个位点的sgRNA，可通过sgRNA设计软件筛选移码突变率高且脱靶位点少的sgRNA；
（5）基因有多个转录本时尽量将sgRNA设计在同源区；
（6）如果想要造成移码突变，则必须设计在CDS区，需尽量靠近编码蛋白的N端，最好位于第一或第二外显子上，以产生无功能性蛋白。

sgRNA设计流程




sgRNA设计示范

1、NCBI获取基因信息，选择编辑区域

在NCBI主页Gene界面输入“物种”、“基因名称”，搜索对应的基因。此处以人类AKT1基因为例；




点击对应的选项，下拉至“Genomic regions, transcripts, and products”区域，可以看到该基因有多个转录本，竖行绿色方框代表外显子，每种转录本共有的方框即是同源区；





点击Genebank，下载序列，用snapgene打开，即可查看每个同源区对应的具体碱基序列；






竖行方框代表外显子，为敲除尽可能多的AKT1蛋白确保转录本亚型都不能表达，所以应该敲除掉这些亚型共有的区域，而且越靠近CDS区的ATG起始密码子越好。

2、设计、选择sgRNA

确定好靶基因的编辑区域后，小编为大家介绍2种sgRNA设计网站：
① Cas-Designer
(http://www.rgenome.net/cas-designer/)
在小编之前的推文里已详细介绍了Cas-Designer的使用，有兴趣的小伙伴可以移步（基因编辑工具分享（二） | sgRNA设计线上工具Cas-Designer），舒桐自主研发的FrCas9已被Cas-Designer收录，可更方便的进行sgRNA设计。




② 张锋实验室CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）
输入上述已选中的同源区域的碱基序列，选择正确的物种和Cas9蛋白。



网站生成的sgRNA序列信息如下，包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息。




除了上述2个网站外，另外2个网站：CHOPCHOP （http://chopchop.cbu.uib.no/ ）、E-CRISP （http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）也可进行sgRNA的设计及脱靶预测。在此，小编提醒小伙伴们，每个网站的评分规则不一样，相同的sgRNA序列在不同的网站可能各方面评分并不一致，大家需要根据自己的实验需求多方评价，选择最合适的sgRNA。

FrCas9介绍

由舒桐科技研发团队经数年潜心研发的“一种2型CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用”成功通过俄罗斯发明专利申请，获得联邦知识产权局授权，并取得“授予发明专利权通知书”。CRISPR-FrCas9是目前已知的切割效率最强、脱靶效应最低、特异性最好、PAM限制最少的CRISPR，显著优于SpCas9，极大程度保证了基因治疗的安全性、有效性。

选择舒桐科技的优势

（1）提供sgRNA设计服务；
（2）提供sgRNA质粒构建服务；
（3）提供高纯度、高活性的SpCas9、FrCas9蛋白。

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，产品质量达到领先水平，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

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参考文献：
[1] Cui Z, Tian R, Huang Z, Jin Z, Li L, Liu J, Huang Z, Xie H, Liu D, Mo H, Zhou R, Lang B, Meng B, Weng H, Hu Z. FrCas9 is a CRISPR/Cas9 system with high editing efficiency and fidelity. Nat Commun. 2022 Mar 17;13(1):1425.

队长是我

CRISPR（Clustered,  Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats）– Cas 系统在微  生物中进化，作为防御入侵噬菌体的防御机制。这个系统是一套基因编辑工具的基础，这些工具能够在从健康和诊断到农业和能源的广泛研究领域取得进展。更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn

基因编辑是对DNA序列的一种特定的、有针对性的改编，涉及到DNA的添加、去除或修饰。CRISPR 系统通过两个主要组件完成基因编辑：
1、向导RNA（gRNA）
2、细菌来源的核酸酶（如 Cas9）
gRNA是一个特定的RNA序列，旨在识别核酸酶并将其导向目标脱氧核糖核酸区域，它由两部分组成：CRISPRRNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。crRNA是与靶DNA互补的  17-20个核苷酸序列，因此根据靶基因而变化。相反，tracrRNA是一个不变的序列，作为将Cas核酸酶连接到crRNA的支架。
第一个CRISPR编辑系统使用了一个由两部分组成的gRNA复合物，由一个单独的crRNA和tracrRNA组成，但现在标准的做法是使用一个单一的gRNA（sgRNA）方法，将crRNA和tracrRNA结合成一个RNA分子。图1显示了CRISPR基因编辑复合体的总体示意图

队长是我

crRNA即CRISPR RNA，而tracrRNA（trans-activating crRNA）即反式激活crRNA；在CRISPR/Cas9系统中,crRNA会与tracrRNA结合形成gRNA(guide RNA),然后Cas9蛋白在gRNA的协助下精准定位到靶位点，最终完成DNA双链的精准切割。

队长是我

crRNA是CRISPR RNA的简写，tracrRNA是trans-activating crRNA的简写。crRNA以前体pre-crRNA的形式被转录，tracrRNA单独转录，tracrRNA和pre-crRNA通过碱基配对作用结合，经过RNaseIII修剪，并与Cas9结合，成为具有DNA切割能力的复合体。
现在人工改造的版本中tracrRNA和crRNA被整合成了一个RNA转录出来，通过碱基配对作用，自折叠成部分双链的RNA结构，与Cas9结合发挥功能。


参考文献：https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR