从室间质评看肿瘤MSI检测质量

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关于微卫星不稳定性（MSI）的临床价值，如辅助筛查林奇综合征、指导免疫治疗、某些实体瘤的预后因子并可预测化疗疗效等，上篇文章已做过介绍。
对于MSI检测，我个人早期其实并不了解。但从2018年开始，我在上海地区不少分子病理检测实验室中发现大家都在开展此项目，且用的都是无证试剂，这显然并不合规。我就很好奇地请教其原因，有老师详细给我解释了开展此项目的必要性，重点即是MSI所具有的重要临床意义，归根结底还是为了满足临床需求，服务肿瘤患者。
了解了相关背景后，我开始查找相关检测信息，发现当时MSI检测无一有证产品，实验室所用无证试剂的临床性能能否有效满足临床需求不得而知。此外，不同检测试剂选择的微卫星位点也各有差异，如不同厂商会分别选择2B3D panel、Promega panel或其他panel，不同Panel的检测敏感度和特异性可能也存在不同。上述因素可能导致MSI检测结果不一。
还有就是，前文也提及PCR-毛细管电泳法是当前MSI检测的金标准，而相比常规荧光PCR，其检测流程要更为复杂（见下图），任一环节出现问题也会影响检测质量。



而准确检测MMR/MSI状态对于肿瘤患者能否获益至关重要，我想大家也都很想看看实验室MSI检测质量到底如何。于是，我们开始着手策划MSI检测的室间质评（EQA）活动，需要解决的主要问题即是质控品样本类型及来源。相比其他项目，MSI检测较为特殊的一点是其需要对照/配对样本，这也导致我们无法像其他项目一样自行制备质控品。最终，在合作伙伴（上海市临床病理质量控制中心/复旦大学附属肿瘤医院病理科）的大力支持和帮助下，我们选择了临床样本作为EQA样本，从而顺利解决了上述问题，并于2021年正式启动该调查项目。
连续进行两年EQA活动后，我们将相关数据汇总成文，论文也于9月中旬见刊于Expert Review of Molecular Diagnostics杂志。



下面我将2021-2022年EQA数据简单介绍下，希望对已开展或打算开展相关项目的实验室能够有点帮助。
EQA样本源自肿瘤患者组织样本，每轮次制备的样本均经系统验证，包括预期靶值（IHC分析和PCR毛细管电泳法检测）和稳定性评估等，样本经证实可满足使用需求后投入后续使用。每一轮次样本盘共计5个样本，包含3-4个MSI-H及其对照样本，1-2个MSS及其对照样本，具体组成情况如下：



本项目EQA活动为自愿参加，样本盘经快递运输至各参评实验室进行检测，参评实验室数量如下图所示。可见相比2021年初次开展时，2022年参评实验室数量明显增加，特别是新增了不少第三方医学检验实验室。



核酸提取质量及得率对于检测结果起着重要影响。我们对参评实验室所用核酸提取方法进行汇总，发现大部分实验室仍使用手工提取方式进行核酸提取。



参评实验室所用试剂情况如下。恰好2021年开展EQA前，NMPA批准了桐树生物MSI检测试剂，因此2021年EQA中仅有1家有证试剂，其余均为厂家提供的无证科研试剂或实验室自建方法；阅微基因2021年下半年拿证，鑫诺美迪2023年才拿证，则2022年EQA中有桐树和阅微2家有证试剂。但从图中可见，使用有证试剂的实验室在所有实验室中占比较少，说明大部分实验室仍在使用无证试剂进行检测。



随后，参照如下标准对检测结果进行评价：实验室检测结果与样本靶值完全一致为符合，否则为不符合。如0-1个样本不符合为成绩“合格”；＞1个样本不符合为成绩“不合格”。需要说明一点的是，实际操作中我们采用上述评价原则主要还是为了提高大家的整体合格率，因此最终绝大多数实验室收到的反馈报告成绩是合格的。
但是，考虑到MSI检测结果在肿瘤患者临床诊疗决策中的重要性，我们认为参评实验室样本检测结果应该100%符合。因此，在最终论文数据汇总时，我们将EQA成绩按以下原则进行判定：回报样本结果100%符合成绩为合格，否则为不合格。最终，成绩分布情况如下图所示，可见2轮次EQA的整体合格率分别为74%（20/27）和92.7%（38/41）。虽然2022年使用实验室自建方法的实验室家数明显增加，但参评实验室整体合格率明显提高，这进一步说明检测试剂只是检测质量保证的一个关键要素，同步做好其他相关环节质量保证，才能有效保证检测质量。



2021年，7家实验室出现了8个错误样本，其均为假阴性结果，即MSI-H回报为MSI-L或MSS。对于错误样本，除1样本外，其它7个均出现在2225号样本，该样本也为所含核酸浓度最低样本（下图）。考虑不同实验室间DNA抽提得率差异较大，这可能是导致假阴性发生的原因之一；此外，不同检测试剂的灵敏度间可能存在差异，这也会导致假阴性结果出现。2022年，3家实验室回报了5个错误样本，其中2家实验室分别出现了1个假阳性和1个假阴性结果，推测可能为实验室操作过程或回报结果时样本编号出错所致。



小结
从MSI室间质评结果可以看出实验室整体检测能力尚可，个别实验室检测能力需进一步改进。部分2021年成绩不合格实验室顺利通过2022年MSI室间质评，说明EQA可持续提升参评实验室检测质量，这进一步强调了实验室定期参加室间质评的必要性。
2021年前，NMPA尚未有获批的MSI检测试剂，实验室使用无证产品实属无奈之举，但截至目前NMPA已批准3款相关产品。因此，实验室应优先选择有证试剂进行临床检测，这不论从产品性能保障，还是合规角度而言均应如此。如实验室仍使用无证试剂，需务必做好性能确认等工作。此外，不管是使用有证还是无证产品，实验室应严格做好全流程（分析前、中、后）质量保证工作。
最后，再次强调一点，加强人员检测能力建设是保证检测质量极为关键的一环，如本EQA项目中大部分错误结果，都可通过提高人员能力而避免。
综上，各实验室应采取多种措施保证MSI检测质量，以为临床提供更为精准的检测结果，使得广大肿瘤患者最大程度获益。

来源：临床分子检测

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