什么是CRISPR-dCas9系统？

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什么是CRISPR-dCas9系统？
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长长的路

dCas9（dead Cas9）是Cas9蛋白的突变体，即因Cas9的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变产生，其剪切酶活性丧失，只保留了由gRNA引导进入基因组的能力。目前，CRISPR-dCas9系统已被广泛应用于基因调控、基因组成像、表观遗传调控等方面。



Sp-dCas9蛋白RuvC1 ( D10A )和HNH ( H841A )结构域突变，核酸酶功能丧失（Beyond editing: repurposing CRISPR–Cas9 for precisiongenome regulation and interrogation）

CRISPRi
dCas9可以结合目标基因组DNA序列，产生空间位阻，阻止其他DNA结合蛋白（如内源性转录因子和RNA聚合酶II）的活性，从而干扰基因表达（CRISPR interference，CRISPRi）。在细菌中，使用基于dCas9的CRISPRi方法可以高效抑制基因表达，特异性高、脱靶率低，并且可以利用多个sgRNAs同时控制多个基因。在哺乳动物细胞中，将dCas9与强阻遏复合物如Kruppel相关盒融合会诱导其产生更强及更特异性的转录抑制。与Cas9诱导的永久性基因修饰不同，CRISPRi对基因的抑制是可逆的。缺点是dCas9可能会抑制操纵子内的下游基因表达而不是单个基因，仍需要进一步的研究来扩展该方法，以便在全基因组范围内选择性地干扰基因表达。
CRISPRa
CRISPR介导的基因激活称为CRISPRa（CRISPR activation），利用dCas9融合蛋白招募转录激活因子。dCas9与大肠杆菌聚合酶的ω-亚基融合，可将全酶组装在目标启动子上，用于转录激活。在哺乳动物细胞中，将dCas9与VP64或p65激活域（p65AD）融合可以在仅一条sgRNA引导条件下同时激活报告基因和内源性基因。然而，使用多个sgRNA以实现源基因的显著激活仍是必要的。



CRISPRi 和CRISPRa用于转录抑制和激活（Beyond editing: repurposing CRISPR–Cas9 for precisiongenome regulation and interrogation）