Western Blotting你了解过吗？

John

什么是Western Blotting？
蛋白免疫印迹（Western Blotting）是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定蛋白的一种蛋白质检测技术。蛋白表达→蛋白抽提纯化→蛋白浓缩除盐→蛋白电泳→Western Blotting→ 蛋白分析
Western Blotting 工作流程
转印

• 高载量Immobilon®-PVDF转印膜
  
• 小分子蛋白转印专用Immobilon®-PSQ 转印膜
  
• 荧光检测专用Immobilon®-FL转印
  
• Immobilon®-E即用型
  

封闭与抗体孵育

• 小分子 Bløk ®封闭剂
  
• 优质抗体免疫信号增强试剂
  
• SNAP ® i.d.2.0 加速器
  

检测

• 预混 Immobilon ® HRP 底物
  
• 高性价比 Immobilon ® HRP底物
  
• 超高灵敏度Immobilon® ECL
  
• Ultra HRP底物
  
• ReBlot™ 多轮杂交试剂盒
  
• 优化低丰度蛋白检测组合
  
• 优化荧光检测组合
  
• 优化磷酸化检测组
  

转膜
【PVDF膜和NC膜区别在哪】
通常，PVDF膜蛋白吸附能力强，而NC膜背景更干净；PVDF膜由于疏水等原因，所以使用前需要100%甲醇浸润；NC膜使用方便但比较脆。如果蛋白丰度较低，推荐使用PVDF膜。【膜有多种孔径，该如何选择】最常用的膜孔径是0.45 μm，适合检测分子量>20kDa的蛋白。0.2 μm 孔径适合检测10-20kDa之间的蛋白。0.1 μm 孔径适合检测<10kDa的蛋白。
【 PVDF膜可以反复杂交么？】
对于PVDF膜上的大部分蛋白，在stripping后重新封闭杂交，仍然能够进行显色出条带。
【湿转和半干转如何选择】
半干转时间短速度快，试剂耗费少，但前期需要几次的摸索，且不同的半干转印仪器转印条件相差较多。湿转成功率高，但相对费时，可根据实验条件和个人喜好来选择合适的方案。
【Immobilon® PVDF转印膜】
PVDF膜作为Western Blot转印膜的主要优点
•载量高：蛋白吸附能力强，结合稳固，保证低丰度蛋白也能成功检测
•物化性能稳定：延展性好且化学兼容性好，不像纯硝化纤维那样易翘易脆裂，可长时间存放，更方便做多轮杂交
•多种品种供选择：可以根据蛋白的分子量、丰度和后续的检测方法（如化学发光或荧光）选择最合适的膜
【Immobilon®-E即用型PVDF转印膜】
Immobilon ® -E 即用型转印膜是一种新型PVDF 膜。与传统 PVDF 不同，Immobilon ® -E 在转印前无需用醇溶液预润湿，可直接使用标准转印缓冲液润湿。与硝酸纤维素膜相比，它有 PVDF膜通常具有的优点，包括更好的操作性能和染色能力、强溶剂抗性和高信噪比，因此具有更高的灵敏度。Immobilon ® -E即用型转印膜孔径为0.45μm，是大多数Western免疫印迹的理想之选。
•更安全而方便：是目前市场上唯一的不需要高浓度甲醇预润湿、操作类似NC膜的PVDF膜
•低丰度蛋白和常规检测：蛋白载量高，信噪比优越
•物化性能好：柔韧易操作，试剂（溶液、染料）兼容性好，适于长时间存放
•支持重复检测：性能稳定，可进行多次抗体剥离和再杂交

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