做ELISA实验需要注意哪些问题？

wolf

做ELISA实验的时候会遇到一些问题，如样品稀释,加样,温育等，应当注意些什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/50131295

清风寡欲

作为免疫学三大实验之一的ELISA实验，都说很简单，但是为什么还是有很多人做不好这个实验？
作为一个每天都在做ELISA实验的老实验人，从屡战屡败到屡战屡胜，我今天分享的这份实验宝典，真的很厉害，基本把ELISA实验知识点都说透了，很值得收藏学习！

讲ELISA实验之前，先给大家分享实操的视频资料，可以作为辅助学习资料，有需要可以自行保存！
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酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最广泛的免疫学检测技术，是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
常用的ELISA方法
目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法ELISA。


#01直接法
将抗原固定于ELISA班上，然后用酶标抗体直检测抗原。
相较于其他类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错，
但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA版结合，实验背景会比较高，而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。
#02 间接法
将抗原固定于ELISA班上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体于抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
于直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，间接ELISA还提供了更大的灵活性，
缺点：存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。
03# 夹心法
被检测的抗原包被再两个抗体之间其中一个抗体将抗原固定于载体上，即捕捉抗体，另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量，或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量，这两种抗体必须小心选取，才可以避免交互反应货竞争相同额抗原结合部位。
04# 竞争法
预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验是，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体，如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比
竞争ELISA相对以上的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式，其主要有点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。
在测定蛋白质等大分子时常用双抗夹心ELISA方法，在敏感性基因特异性上有明显的优势。
双抗夹心法ELISA
#01 原理
双抗体夹心法是检测大分子抗原最常用的方法。双抗夹心法ELISA是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体—抗原—固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。


#02 样本准备

• 血清 全血标本自然凝集30min后1000×g离心15min，取澄清，即可检测。澄清可存放于-20℃，避免反复冻融。
  
• 血浆 可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于2-8℃1000×g 离心15min，或将标本放于-20℃，避免反复冻融。（注意：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测）
  
• 细胞上清
  

收集细胞培养液，离心取上清，-20℃存放，避免反复冻融。
D.细胞裂解样本
①收集细胞后，用预冷的10mM PBS洗3次，5000×g离心5min。
②细胞计数，离心弃上清；
③加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；
④按每1×107个细胞，加入1ml细胞裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，其间上下颠倒使裂解更充分，超声波破碎处理；
⑤ 4℃，10000×g离心10min；
⑥检测细胞裂解样本总蛋白浓度；
⑦整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。
E. 组织裂解样本
①加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；
②预先将待检组织用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg组织加1mL裂解液，用研磨器进行研磨，得到的匀浆液可利用超声破碎处理；
③4℃，10000×g离心10min，取上清，-80℃存放；
④检测组织裂解样本总蛋白浓度；
⑤整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。
#03 实验操作流程
1.标准品和样本制备
2.酶标板拆分
3.标准品和样本点样
4.生物素抗体制备
5.洗液配制
6.浓缩HRP酶结合物工作液配制
7.显色
8.终止反应
9.上机与数据分析
如何选择ELISA试剂盒？
1.特异性：ELISA试剂盒的特异性于试剂盒的关键组分，抗体对有关，若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，建议使用双单抗，
2、灵敏度：灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户可根据自己样本中待检指标的量选择合适的试剂盒，如果待检指标量很低，一般的试剂盒不能满足要求，可选择高敏的ELISA试剂盒。
3、重复性：科学实验讲求重复性，一般ELISA试剂盒，期板内和板间变异系数应该控制在15%以内。
4、简便性：试剂盒在保证高质量数据的情况下，实验时间越短，操作越便利，越容易受到用户欢迎，
ELISA 试剂盒常见问题解析










10条ELISA 实验通用技巧

• 室温 确保所有试剂在使用前均平衡至室温（除非另有说明）。
  
• 防潮 如果有剩余检测孔，则将剩余的孔板密封保存，以防止有效成分降解。
  
• 分装 对于非一次性使用的标准品，将剩余标准品等分至较小体积并冷冻保存，以防止反复冻融。
  
• 使用多道移液器 多道移液器可以加快标准品和样品的铺板速度，并得到更一致的结果。
  
• 加样角度 加样时，将移液器枪头保持一定倾斜角度，不要接触微孔底部。
  
• 更换移液器枪头 建议在不同样品或标准品之间更换移液器枪头，以防止污染。
  
• 尽量使用洗板机 因为使用多道移液器手动洗板可能导致更高的背景，因此建议使用洗板机。
  
• 增加浸润时间 在手动或用洗板机清洗微孔板时，在两次洗板步骤之间增加 30 秒的浸润时间，便于洗涤缓冲液发挥功效。
  
• 孵育时间 密切关注孵育时间，每小时孵育时间的误差应控制在 5 min 内。
  
• 多板操作，切勿叠放
  

如果正在进行多板操作，请勿在孵育期间将微孔板堆叠在一起，而应单独放置在平坦表面上。
ELISA与IHC、WB的区别



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大力水手

酶联免疫吸附测定法是最基础的免疫学实验之一，ELISA看似简单，实则不然。ELISA是一个非常严谨、极考验操作者技巧和经验的实验，检测结果没有读值、高cv值、高背景等诸多问题也是兵家常事。为了更好的解决这些问题，我们列举了Elisa实验中常见的一些问题及解决方案。希望对各位从事科研工作的小伙伴有所帮助。
一、显色浅，灵敏度低

原因	解决方法
试剂盒运输时间过长，受高温天气影响酶的活性降低	试剂运输过程中放足够的冰袋并尽可能缩短运输时间
试剂盒（包括未使用完的板条及其他组分）保藏条件不正确	试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板条要密封保存
试剂盒使用时间已超期限	过期试剂盒不可使用
温育时间不够	严格按照说明书操作
恒温箱温度达不到37℃	注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37±0.5℃。尽量避免频繁开关恒温箱门
加样量不足;移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多	经常校正移液器，注意吸头要与移液器吻合。移液不宜过快，排放要完全
显色剂加量不足	按照说明书要求加入适量显色液
试剂、样品使用前未平衡至室温	试剂、样品从低温保藏条件中拿出来
试剂开启时间过长，污染	试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完

二、出现假阳性，背景高甚至花板

原因	解决方法
加样时污染	注意更换枪头，尽可能避免污染
加酶时污染	对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换吸头，切忌侥幸心里
恒温箱温度过高	注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37士0.5℃
整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔与最后一孔反映应时间相差很悬殊）。气温高时更明显	在尽可能短的时间内完成操作;尽量不要堆积块板子操作（尤其手工操作时）
洗液稀释倍数过高	按照要求倍数稀释洗液
洗板时浸泡时间不够	按要求操作，并适当延长浸泡时间
洗板次数不够	按要求操作，不可任意减少洗板次数
手工洗板方式不对	洗板时垂直加入洗液，并保证一定的冲击力;洗板要注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时间
酶、显色液污染	使用容器要注意容器的清洁，避免污染
显色完后没有终止反应	显色完立即终止反应

三、重复性不好

原因

加样量多少不一，操作时间长短不一

加入标本后没有混匀

重复实验的操作人员不同，操作习惯不同

反应时间、温度等不同

标本不同（被混添或者处理不同）

解决方法：重复同一样品时，加样量与加样时间相同；同时注意移液器的校准。加样后应该将酶标板放置在微量振荡器上，充分混合；标本保证一致、无污染；尽可能由同一名操作人员操作，尽可能模拟相同的反应条件。
四、白板

原因	解决方法
忘记加酶	严格按照说明书操作
忘记加显色液	严格按照说明书操作
酶或显色液污染失效	防止组分被污染，注意保存
把终止液当显色液	可以在加样槽上贴标签避免错加

五、标曲有值样本无值
原因：样本孔没有读值或读值极低。
解决方法：1.分析标准曲线的读值、标准曲线R值、背景值高低等，例如，即使标准曲线最高值只有1.2，但R值为0.999，这样的标准曲线同样可用；2.如果标准曲线正常，则可以排除ELISA试剂盒的品质问题，此时需要考虑样本中目标蛋白的表达含量，从实验经验来看，样本中目标蛋白表达量低是没有读值最常见的原因。
为减少在试验中可能碰到的问题，应严格按照试剂盒内说明书操作，使用前应检查盒内试剂是否超过有效期，并确定所有试剂齐全。赶紧收藏点赞一会找不到了！！

大力水手

1、什么是ELISA？





ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种免疫测定方法，通常用于量化样品中特定目标的水平。常规用于ELISAs的样本包括血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液。
酶联免疫吸附试验通常在96孔微孔板中进行，微孔板上涂有对相关分析物的特异性捕获抗体。在与实验样品、标准品或对照品孵化时，目标分析物被该抗体捕获，一个共轭的检测抗体与目标分析物上的不同表位结合。随后加入底物溶液，产生一个与分析物结合量成比例的信号。
2、ELISA的方法学

ELISA的四个主要方法学是间接法、直接法、夹心法和竞争法，每种类型的ELISA都有自己的优势和劣势。
2.1、直接法

在直接法中，抗原或样品被直接固定在平板上，一个共轭的检测抗体与目标蛋白结合。然后加入底物，产生一个与样品中分析物数量成比例的信号。由于在直接法中只使用一个抗体，它们的特异性比夹心法低。


在评估抗体亲和力和特异性，或者调查阻断/抑制性相互作用时，我们会选择直接法进行检测，直接法是一种快速和简单的方法，但是它的特异性较差，因为只使用一个抗体，同时如果一个样品中的所有蛋白质都被固定在孔中，可能会出现高的背景杂音。
2.2、间接法

间接法与直接法相似，抗原被固定在一个板上，但它包括一个额外的扩增检测步骤。


首先，加入一个未结合的初级检测抗体并与特定的抗原结合。
然后加入针对初级抗体的宿主物种的结合的二级抗体。然后底物产生一个与孔中结合的抗原量成比例的信号。
在测量内源性抗体时，我们会选择使用间接法，因为它使用使用第二抗体进行扩增，特异性更好，但这也带来了一个问题，二次抗体有可能引起交叉反应。
2.3、夹心法

夹心法是最常见的ELISA类型，它用两个特定的抗体被来夹住抗原，这通常被称为匹配抗体对。


捕获抗体被涂在微孔板上，加入样品，感兴趣的蛋白质结合并固定在板上。然后加入共轭检测抗体，与目标蛋白上的另一个表位结合。加入底物并产生一个与样品中存在的分析物数量成比例的信号。夹心法具有高度的特异性，因为需要两个抗体与感兴趣的蛋白质结合。
我们在确定生物样品中的分析物浓度时，往往会使用夹心法，这就是因为它具有最高的特异性和灵敏度，并且适用于复杂的样品基质，但需要注意的是，夹心法往往检测时间较长，而且开发难度要大于其他方法学。
2.4、竞争法

竞争法通常用于检测小分子，例如当感兴趣的蛋白质太小而不能有效地与两个抗体夹层时。


与夹心法相似，捕获抗体被涂在微孔板上。不使用共轭的检测抗体，而是使用共轭的抗原来完成与样品中的抗原的结合。样品中存在的抗原越多，共轭抗原与捕获抗体的结合就越少。加入底物，产生的信号与样品中存在的蛋白质数量成反比。
我们在测定小分子和荷尔蒙的浓度，会使用竞争法，这也是由于它具有对小分子进行定量的能力，但是，竞争法的特异性较差，因为只使用了一种抗体，而且需要有能够结合的抗原。
3、ELISA相比其他技术的优势

有许多不同的免疫测定平台可用于测量生物体液中的蛋白质水平。在许多情况下，由于ELISA的灵敏度、特异性、准确性以及对苛刻的缓冲液或预处理的耐受能力，ELISA是首选。
比较ELISA和Western blot，夹心法使用2个特异性抗体而不是一个，可以得到完全定量的结果，而Western blot可以看到非特异性条带，最多只能是半定量的。
而与不同的复用平台相比，ELISAs的一个优势是能够为目标分析物定制检测方法，而且不必担心许多其他抗体和蛋白质一起工作造成的干扰。
而且，通过对使用的抗体、稀释剂等进行优化，可以极大地降低交叉反应或干扰的可能性，从而实现在复杂的样品基质中对分析物有出色的灵敏度和特异性。
诊断科学编辑团队收集、整理和编撰，如需更多资讯，请关注公众号诊断科学（DiagnosticsScience）。
＊＊＊

检验医师

实验笔记丨ELISA实验，你真的学废了吗？
酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。利用这种基于抗原抗体杂交的技术，我们可以量化检测可溶性物质，如蛋白质，在ELISA中，抗原作为目标分子，被固定在（特定的固相载体上），并被特异性的，与酶偶联的抗体检测，当提供无色底物时，酶产生可测量的有色底物。

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。





酶联免疫吸附试验（ELISA）是最常用的血清学检测方法，既可以检测抗原也可以检测抗体，主要包括间接ELISA、竞争ELISA、捕获 ELISA以及双抗夹心ELISA。其中，间接 ELISA操作相对简便，结果清晰，在抗体的检测中最为常用。该方法灵敏度高、特异性好，并且可以实现批量检测，适合用于对临床样品的大批量检测。
实验步骤


间接法 - 常用于检测抗体


（1）按实验需求配置标准品，S0-S7；
（2）稀释待测样本和加样；
（3）配置抗体，加样，室温孵育1-2h；
（4）配置洗涤液；
（5）洗板；
（6）配置辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（HRP）；
（7）3次洗涤结束后，加入稀释后的 HRP 100µL/孔，室温孵育1h；
（8）洗板；
（9）加底物溶液；
（10）加终止液；
（11）加入终止液，使用酶标仪测定各孔吸光值（OD 值）。
注意事项

温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。温育温度应在37℃，水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。温育实际测定操作中要注意以下几点：

1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够，弱阳性样本测不出来。

2）因为采用水浴，所以在温育时一定要封板，防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染，并有可能整板花板。

全自动洗板机的使用应注意以下几点：

1）洗板前，应检查洗液瓶、蒸馏水瓶是否充足，废液瓶是否满瓶。

2）在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅，排液是否通畅。3）在洗板过程中，应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢，每孔吸水是否吸尽，并且要保证洗液在孔中放置的时间。如果手工洗板的话就更需要操作者的操作技巧。

更多实验笔记干货，请关注“科研日精进”微信公众号

同花顺

一、ELISA操作前准备工作
试剂盒的选择
ELISA操作前，应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。
样本处理
在收集标本前需有一个完整的计划，需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。
二、ELISA标准品溶解
标准品是试剂盒的检测抗原的一个度量标尺，因此标准品的溶解、倍比稀释和保存要特别注意以下细节：冻干标准品溶解按照说明书的要求，准确复溶。在冰上操作标准品为佳，静止5-10分钟，轻轻摇匀后按照一次量分装，在-20度或-70度保存。标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备，如离心管的准备和编号以及稀释液的准备;稀释时，应充分混匀;采用进口或者硅化的EP管，减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。
三、ELISA操作中的洗涤
洗涤是ELISA实验中是最多次数的操作，也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象，实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管，还是洗板机，严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象，请比照“手工洗板小贴士”操作：
a)洗液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定会增高。
b)特别注意：设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体!甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
c)用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大。
d)每次拍板不要重复在一个地方拍，特别是洗去酶的步骤;拍板不宜过轻，否则拍不干净，拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重，以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下，最后一次一定要扣干净。
e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短，洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。
四、ELISA的标准曲线如何拟合?
一般情况按照说明书推荐方法拟合标准曲线。标准曲线可以由酶标仪附带软件自动生成，也可手动制作。标准曲线呈“S”形曲线，两端趋于水平，中间趋于线性，中间部分为较佳的检测范围。当标准品的量超过与包被抗体结合的量，此时标准品已饱和，再增加标准品的量，其OD值不再变化，故当标准品达到一定浓度后，曲线就趋于水平。一般厂商给出的浓度范围落在中间线性范围，根据标准曲线，可以测出样本的浓度。按照科学分析方法，如果存在“奇异点”或者“污点”，直接采用线性分析不是很好，要对拟合标准曲线的几个点进行取舍，同时也可改用双对数直线拟合或者四因素曲线拟合。
五、常见问题
1、ELISA试验出现非常弱的结果，常见有7种原因，其解决方法如下：
1)可能原因：温育的时间或者温度不够;
解决方法：校正温育箱温度。
2)可能原因：显色反应时间太短;
解决方法：校正定时钟准确定时。
3)可能原因：所用配制缓冲液的蒸馏水有问题;
解决方法：使用新鲜合格的蒸馏水。
4)可能原因：加入抗体/酶的稀释液浓度太低;
解决方法：按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密。
5)可能原因：酶标仪滤光片不正确;
解决方法：检查酶标仪使用的滤光片。
6)可能原因：试剂盒没有充分平衡;
解决方法：试剂室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温。
7)可能原因：不正确的试剂储存方式;
解决方法：按照说明书要求保存试剂盒。
2、 试验结果白板，而且阳性对照不显色，应如何分析和查找原因?
答：试验结果白板，而且阳性对照不显色，常见原因如下：
a)可能原因：漏加或者误加试剂;
解决方法：检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。
b)可能原因：试剂过期;
解决方法：使用有效期内的产品。
c)可能原因：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物(叠氮钠
等);
解决方法：使用干净的器皿，正确配制试剂。
d)可能原因：温育的时间或温度不够;
解决方法：校正温育箱温度。
e)可能原因：标准品失活或者丢失;
解决方法：标准品正确保存、溶解和混匀。
f)可能原因：抗体失活或者丢失;
解决方法：更换抗体或者提高抗体浓度
g)可能原因：酶失活或者丢失
检查方法：把工作浓度的酶再稀释20-100倍，取5uL加入50ul的显色底物，终止后显色是否能达到1.0左右，此为酶的粗略估计。
解决方法：更换酶或者提高酶的浓度。
h)可能原因：显色底物失活
检查方法：加少量的工作浓度的酶，TMB是否很快显色。
解决办法：更换显色底物.
3. 试验结果空白背景高，这是什么原因造成的?
答：试验结果空白背景高，常见原因如下：
a)可能原因：洗板不干净;
解决方法：充分洗涤，彻底拍干;洗板要防止交叉污染;浓缩洗液准确配制;吸嘴尽可能一次性使用;加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。
b)可能原因：显色液变质或者试剂过期;
解决方法：检查试剂盒有效期。
c)可能原因：试剂稀释有误，如加酶的浓度过高;
解决方法：请按说明书所示稀释倍数配制;
d)可能原因：蒸馏水受酶等污染;
解决方法：使用新鲜蒸馏水;
e)可能原因：试剂混用;
解决方法：不同批号试剂勿混用。
f)可能原因：培养箱温度超过37℃或反应时间过长。
解决方法：显色反应时间适当缩短。