史上最易懂的流式细胞实验设计指南

balabala

流式细胞术是非常让人着迷的实验。在众多医学研究手段里，如果说弱水三千只取一瓢的话，那我会首选流式细胞术。从我个人感受来讲，流式细胞术高速客观，具有统计学意义，能够处理复杂样本并同时获取多种参数，最最关键的是它性能可靠，可重复性非常好。
虽然也存在一些局限，但流式细胞术比起传统的细胞生物学研究手段来讲完全可以获得「独孤求败」的桂冠了；如果算上共聚焦和膜片钳，当真可以算拉动现代细胞生物学的「三驾马车」了。



什么是流式细胞术

虽然介绍流式细胞术的入门文章很多，很多同学也对流式细胞术耳濡目染已久，看师兄师姐做过无数，可真到自己做的时候却又总出问题。据毛老师多年观察，很多同学在实验设计的时候就埋下了隐患，最常见的问题就是对照设置不合理，最后导致整体实验失败或数据不理想。因此，今天我们来谈谈成功的流式细胞实验设计都需要设置哪些对照。
毫不夸张地说，设置合理的对照组是整个实验成功的关键；反过来说，如果你掌握了流式实验如何设置对照的精髓，对整个免疫学相关的实验设计都会有极大地帮助。
流式对照至少有 5 种：生物学对照，空白对照，同型对照（Isotype control），补偿对照（也叫单阳性对照）和 FMO 对照，主要目的是为了避免出现的假阳性或假阴性结果。下面我们以一个具体的凋亡实验来看看如何设置对照组。下图是 Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图。



Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图

比如有两组细胞，一组给予药物处理（Treat 组），一组给予 DMSO 溶剂（Vehicle 组），拟用 Annexin V/PI 检测凋亡，我们来看看都需要设置哪些对照。

1、生物学对照

这个很容易理解，也是很多同学最早设立的对照。这里 Vehicle 组就是生物学对照组。可能很多同学想象力就局限于此了，有了生物学对照就够了呗，还需要额外对照吗？答案是肯定的，别忘了流式细胞术也是一种免疫学实验，下面我们继续来设置对照。
2、空白对照

在流式上机检测前，我们还需准备额外一组细胞（正常或处理过的皆可），什么染料也不加，作为空白对照。为什么要设置空白对照呢？除了阳性荧光信号之外，我们还需要排除样本是否自带荧光背景，所以要用空白对照来验证在各个检测通道上的信号是否都是阴性。
3、同型对照（Isotype control）

这个对照很多同学都比较陌生。这个还得从抗体结构说起。大家知道抗体是个 Y 字形的，Fab 区域是特异性识别抗原的。在做蛋白免疫印迹时，只需考虑 Fab 的特异性就可以了，但是细胞的话稍微有点不同，因为有些细胞，特别是免疫细胞（B 细胞，T 细胞，巨噬细胞等等），它们表面有 Fc 受体，所以这个同型对照是为了评估抗体 Fc 段与靶细胞的结合情况。如果还不懂的话请看下图。



对比图

所以在做免疫细胞的流式检测时，我们通常都需要加入 Fc 受体封闭剂，之后再加入目标抗体的 isotype 作为同型对照，来排除细胞 Fc 受体造成的假阳性结果。一般试剂商都会告知该抗体需要使用哪种同型抗体。



请输入图片描述

4、补偿对照（单阳性对照）

要理解这个对照，首先需要知道什么是荧光补偿。一图胜前言，下面这个示意图说得比较明白。



补偿对照（单阳性对照）


简单来说，需要使用几种颜色的抗体，就需要设置几种颜色的单阳性对照。这个对照可以用细胞来做，也可以特殊的微球的来做。这里严重推荐使用补偿微球来作为补偿对照，一是能节约时间和样本，二是，有时候自己做的单阳性对照效果不佳，阳性信号不强，就失去了补偿对照的意义了。下图是我用补偿微球的效果。



补偿微球的效果

5、荧光减一（FMO，Fluorescence minus one）对照

如果只用到两种颜色的话，这个对照可以用单阳性对照代替，如果三种以上颜色的话，就需要再设置 FMO 对照来评估其他荧光染料的干扰和补偿本底，帮助正确设置阳性门。
下图演示如果按空白对照组设定界线之后得到的细胞比例比 FMO 设定的值要大。从这个图可以看出，空白对照仅仅是设定阴性界线，但非阴性并不等于就是阳性，所以还需 FMO 来设定阳性界线。再打个比方，比如人体体温正常是 37°，小于 37° 肯定不是发热，那超过 37° 就一定是发热吗，比如 37.1°？（发热的诊断界线是 37.3°）。



荧光减一（FMO，Fluorescence minus one）对照


所以，综上所述，如果只检测两种颜色的话，至少需要 5 个对照（生物学对照 + 空白对照 + 同型对照 + 2 个单阳性对照）。如果要检测 3 种颜色的话，我们来算算，生物学对照 + 空白对照 + 同型对照（可以不同的 isotype 做在同一管里）+3 个单阳性对照 + 3 个 FMO 对照，一共需要 9 个对照。



荧光减一（FMO，Fluorescence minus one）对照
​只有设置了合理的对照，才能得到准确可靠的结果，小伙伴们 get 到了吗？下次再去做流式，就不会被流式的老师怼得无地自容了吧。如果觉得对您有所启发，请点个赞哦，要是感兴趣的同学比较多，我们下次再继续谈谈样本处理和颜色搭配的问题。

最后想提一点冷知识，流式细胞术（Flowcytometry）是近年来流行起来的叫法，但它和 FACS 严格来说不是同一个意思，FACS 意思是 Fluorescence activated Cell Sorting，以前老一辈们都叫荧光激发细胞分选实验，S 是分选的意思，但实际上很多流式细胞仪还只能做到检测分析，不能实现分选，我们只是习惯用 FACS 来指代流式细胞检测术而已。

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