10分钟搞懂4种DNA提取方法

笑看风云

核酸（Nucleic Acid）在生物界中堪称主宰，是一类非常重要的生物大分子，它在生物的繁衍、发育、维持、衰老和死亡等一切生命活动中扮演着重要的角色，目前，核酸已成为生物化学、遗传学以及其他有关生命学科的热门研究课题，其覆盖面之广、进展之速为其他学科所望尘莫及。 进行核酸研究的第一个前提就是能够将核酸从众多纷繁复杂的生物大分子中提取出来，并纯化到一定程度，以便进行相应的科学研究和实际应用。因此本文将会详细介绍关于DNA提取的相关信息，包括DNA提取的原理、提取过程的注意事项、不同类型样品DNA的提取推荐方法等等。


DNA提取的基本原理

DNA的提取可以简单的分为裂解和纯化两大步骤，裂解是破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
裂解过程

常规的裂解液都含有去污剂 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl等)。去污剂的作用 1.使蛋白质变性； 2.破坏膜结构； 3.去除与核酸相互作用的蛋白质。盐的作用 1.提供合适的裂解环境，如Tris; 2.抑制核酸酶对核酸的降解，如EDTA； 3.维持核酸结构稳定，如NaCl。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进DNA与蛋白质的分离，同时，也便于后续的纯化操作。
纯化过程

酚氯仿抽提法

该方法包括两个步骤：1.利用酚氯仿对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现DNA与蛋白质的分离；2. 再用醇将DNA沉淀下来，实现核酸与盐的分离。酚氯仿抽提是去除蛋白质的有效手段，但如果蛋白质含量超过了其饱和度，裂解体系中的蛋白质就不会被一次性去除，需要进行多次反复抽提，而每次的抽提均会导致核酸的损失。酚氯仿抽提最大的优势是成本低廉，对实验条件要求较低。
高盐沉淀法


高盐沉淀法是酚氯仿抽提方法的一个变种，其省略了酚氯仿抽提操作的麻烦，并且克服了酚氯仿抽提方法的缺点，只是得到DNA的纯度不够稳定。

柱式法

过柱法利用某些固相介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离，是目前试剂盒提取广泛使用的方法。
一、工作原理
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。


1、采用离心吸附柱和缓冲液系统。样品裂解后，DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高PH值时从硅胶膜上洗脱下来。
2、破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞。
3、白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性。
4、除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中。
5、在高盐环境下使DNA从有机溶剂（如无水乙醇）中析出。
二、优势
离心柱法DNA提取它的优点是比传统的酚氯法提取的纯度高，有利于RNA保护，而且能进行微量操作，以其低廉的价格和相对便捷的操作，渐逐取代了传统DNA提取方法，被高校科研所等市场普遍接受。离心柱法DNA提取的缺点是需要较多的样本，耗材多，对于珍稀样本无能为力，特别是在法医、考古等领域显得力不从心。同时离心柱法DNA提取需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入，特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域，离心柱法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。当面对突发疫情时，更是需要有高通量的DNA提取设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。为此需要一种新的DNA提取方法解决这个实际难题。在这个时代潮流需求的驱动下，磁珠法DNA提取应运而生。
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磁珠法

该方法将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面，通过介质对DNA的吸附，在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动，从而达到核酸与其它物质分离的目的。
一、实验步骤
磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解——结合——洗涤——洗脱


1、裂解核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来，细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。其中，酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链霉蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
2、结合磁珠表面带负电荷，磁珠buffer是高盐环境有带正电荷的盐离子，样本被buffer影响，磷酸基团带负电荷。
3、洗涤核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理性的沉淀剂。当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
4、洗脱加水或者EB破坏高盐环境，形成低盐环境，使DNA从磁珠上脱落。
二、工作原理磁珠法是通过裂解液裂解细胞组织样本，从样本中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。将携带核酸的磁珠移动至不同的试剂槽内，通过反复快速搅拌、混匀液体，经过细胞裂解、核酸吸附、洗涤与洗脱等步骤，最终得到纯净的核酸。磁珠提取DNA原理：电荷的盐离子的作用（如Na+），带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG与盐类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除其三者之间的离子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。



三：磁珠法的特点
高质量、高通量极大满足如今对核酸提取效率的需求 ；灵敏度高 (只需微量的样本)；分离速度快 (磁场分离只需几秒钟)；纯化的纯度高 (核酸完全与杂质分离)；自动化流程 免去了复杂的人工提取；减少酚类、氯仿等有机试剂对操作人员伤害缺点是依赖自动提取仪，价格比较很高，不适用于小型实验室。
DNA提取的注意事项

样品的采集和保存

样品的采集和保存是DNA提取的第一步，合适的样品采集和保存方法对于DNA提取的成败至关重要，尤其是有些珍贵样品，其采集和保存的方式更是需要特别关注。
动植物样品采集

动物的内脏和皮肤样品要在动物死亡后2h以内采集，通常采集多个重复，切成小块保存在消毒后的离心管中；动物呼吸道样品通过棉拭子进行蘸取，完成采样后立即置于5mL磷酸盐缓冲液中；动物血液样品采集后，立即加入抗凝剂，封口病竖立插入样品盒，尽量不要使用肝素抗凝；植物样品采集时优先选取核酸含量较多的部位，如植物的幼嫩部位；采集植物样品时建议使用无菌水或75%乙醇擦拭或冲洗干净，再用吸水纸吸干样品表面液体。
微生物相关样品采集

针对微生物研究相关的样品，首先要避免人源污染，采样的器具都应经过高温灭菌，采样过程中要戴手套。其次要关注样品运输和处理的速度，很多环境微生物研究的样品并非来自实验室，而是来源于自然环境，有些样品的采集位点甚至在人迹罕至的地区，这就涉及到样品的运输问题。最理想的样品运输条件是在液氮中冷冻运输，如没有条件也可将样品装入含有冰袋的泡沫箱中运输，如样品运输距离较远、时间较长，最好选择专业的冷链运输公司。针对水体样品微生物群落的研究，需要用抽滤的方式将样品中的微生物浓缩至滤膜上，之后再提取其DNA，通常情况下普遍认为采用0.22μm孔径的滤膜进行抽滤能够收集到水体样品中的完整微生物群落。有时我们会首先使用0.8μm孔径的滤膜对水体样品进行预处理，以去除大的颗粒物质，之后再用0.22μm滤膜收集微生物，这时会遇到一个问题，就是去除的颗粒物质也会吸附一部分微生物，因此造成了最终收集的微生物样品不完整，所以在进行样品处理的时候，一定要首先明确要研究的是被颗粒物吸附的微生物、还是游离态的微生物、或者是完整的微生物群落，以确定最适合的抽滤方案。
样品的保存

绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。如果组织样品不能马上进行DNA提取，短期内可以冷冻于-20℃，稍长时间的保存可以采用无水乙醇进行固定。此外还推荐另外一个可以长期保存的方法，可以使用GBCBIO公司的RNA Locker进行组织样品的保存，这个试剂不仅可以保存RNA，同时也能够防止DNA的降解，保存一年左右的样品，DNA提取的效果同样很好。
DNA提取方法的选择

开展针对某个实验样品的DNA提取之前，一定要先行收集该样品的特性信息，例如该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量等，否则就会造成DNA提取失败，从而无法开展后续实验。只有对实验样品有所了解，才能正确选择DNA提取方法。含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。蛋白酶的作用是分解蛋白质，从而使蛋白质变小，促进蛋白质的游离，基因组DNA是很容易“缠”住其它生物大分子物质，蛋白质被蛋白酶消化变小后，不容易被基因组DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化过程中被去除，使最终获得的基因组DNA的纯度更高。含CTAB的裂解液，是针对富含多糖样品 (如细菌、植物等) 基因组DNA抽提的首选裂解方法。CTAB的质量对裂解效率有很大的影响，尽量使用高纯度的CTAB，并且不要轻易更换生产厂家。CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，一般使用65℃，但如果发现DNA降解严重或者得率太低，可以尝试在37～45℃进行裂解。当对大量纯培养细菌进行PCR鉴定时，可以直接使用未裂解的菌体当作模版进行PCR，只需延长PCR预变性的时间，即可在该阶段完成菌体的裂解并释放DNA。但是该方法由于没有经过纯化的过程，因此可能出现一定的假阳，该方法最适合从大量菌株样本中筛选含有特定基因的目的菌株，但是并不适合判断某一特定菌株是否含有目的核酸片段。
DNA的保存

提取得到的DNA通常使用TE buffer进行最后的溶解，其含有的EDTA可以减少DNA被可能残留的DNase降解的风险，但是如果提取方法合适、操作得当，则几乎不会残留DNase，使用无菌水溶解DNA也是可以的。提取到的DNA一般情况下在-20℃保存是没有问题的，但是要避免反复冻融，因此，最好在提取完成之后按照后续实验所需进行分装，这样每次使用一个分装好的DNA，避免反复冻融造成的DNA降解。如果提取的DNA需要长期保存 (一年以上)，最好保存于-80℃。
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