踩坑多年后的吐血经验，终于能养好细胞了

风云

对于养细胞的人来说
可谓是谈「污」色变
每次养细胞总让人有种神经错乱
一进细胞房就想让空气都静止下来
打开培养皿的一瞬间
连呼吸都变得如此多余

只要有任何异样
无论是支原体还是杂菌
污染！污染！污染！
犹如细胞实验的魔咒
让一切都无限重复……

那么，如何将失败率降到最低，让我们摆脱玄学的漩涡呢？
今天大博士专门为大家盘点了细胞培养进阶超实用干货，基本的培养和常见问题处理都面面俱到，一篇在手，以后你就能与细胞愉快的玩耍了！

BOSTER
一、细胞污染



#1
如何判断细胞污染了？

现象1： 细胞培养液变浑浊了，经常见到是米汤样，黄色液体，一般认为细菌污染。


图1. 细菌污染


图2. 杆菌污染
现象2：细胞培养基内含有能动的小黑点，一般认为是黑胶虫。


图3. 黑胶虫
现象3：培养基清亮，但是能看到飘在培养液带有毛毛的白色的菌状物质，有可能就是真菌感染。


图4. 真菌污染
解决办法：细胞出现污染就直接丢弃，还得把培养箱用酒精棉球擦干净，并用紫外照射半小时，防止再次污染。同时建议细胞培养时，在培养基中加入青霉素和链霉素(尤其是初学者)
#2
细胞培养过程中，细胞周围包括细胞上有很多小黑点，怎么办?



图5. 不动的小黑点，细胞碎片或支原体污染

解决办法：细胞出现黑点一般判定为细胞碎片或杂质，可参照以下进行：

如果是悬浮细胞：收集细胞上清慢速离心（500-600 rpm/min，5-6 min）并更换新的培养瓶。

如果是贴壁细胞：将细胞用PBS洗2-3遍，洗的时候，轻轻拍打培养瓶，让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落，再弃去PBS，消化时先加低浓度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来，去掉低浓度胰酶，然后正常消化细胞，将收集的细胞悬液慢速离心（500-600 rpm/min，5-6 min）并更换新的培养瓶，并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。

如果怀疑黑点是支原体污染，可进行支原体检测，检测阳性请及时将细胞处理后丢弃。比较珍贵的细胞，可以尝试使用支原体清除剂（如泰乐菌素等）去除，并与其他细胞分开培养。
如何预防细胞培养中黑点的产生?

解决办法：掌握细胞传代的最佳时机，不要细胞长老了再传代；掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片；减少血清等试剂的冻融次数；将培养液的PH调到最佳；严格控制水质和器皿的清洁。
#3
细胞培养过程中，发现贴壁细胞表面沾了很多死细胞，传代过程中一直存在怎么破？



图6. 细胞表面一些死的细胞团
解决办法：有一招屡试不爽，那就是用 PBS 洗两遍之后，加胰酶进去，晃一晃，迅速将胰酶倒出，再用 PBS 洗一下，再加胰酶正常消化。死细胞由于粘附能力很弱，第一次加胰酶进去以后会掉下来，第二次加胰酶下来的细胞才是活性比较强的细胞。整完一次之后，再次传代方法同上，一般 2～3 次之后，细胞就完好如初了。
#4
细胞胞质疏松，状态不好，养不起来怎么办?

解决办法1：一般情况下，从血清下手就行，要么换好血清，要么提高血清浓度，血清浓度提高到 15%～20% 培养 48 h，换成正常 10% 的浓度，用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性。

解决办法2：血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法，从培养瓶换到六孔板，12 孔板等，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。

预防办法：细胞胞质疏松，老化的原因在于细胞传代次数比较多，胰酶消化时间太长，这时候，一定要控制细胞传代次数，注意胰酶消化时间，胰酶消化时间过长，容易导致细胞状态不佳以及胞质疏松。
BOSTER
二、细胞传代



根据细胞生长特性的不同，传代可分为悬浮细胞传代和贴壁细胞传代两种类型。对于悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代；贴壁生长的细胞则用消化法进行传代，下面我们将介绍传代培养的一些注意事项。
#1
贴壁细胞传代如何使用胰酶？

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。

消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。

胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。
#2
如何控制胰酶消化时间？
胰酶消化过度会导致细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难以从瓶壁上吹下，反复吹打则会损伤细胞活性。因此，控制胰酶消化时间尤为重要。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作时参考之前的记录来控制时间即可。
#3
细胞抱团如何处理？

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象，大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。

如果出现了细胞团，可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团，也可以尝试以下方法：将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养（该方法只能去除部分较大的细胞团）。
#4
细胞内有空泡，是否是正常现象？

部分细胞本身存在一定的空泡（如HepG2，Ishikawa及一些耐药株等），这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡，则很可能是细胞状态不佳，可以通过调整血清浓度，控制消化，控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态。

如果大部分细胞出现空泡，且单个细胞内空泡数目偏多，则可能细胞代次较高，细胞老化所致，需更换代次较早的细胞。
#5
细胞生长逐渐变慢是什么原因？

l 消化过度

l 传代过密
l 细胞营养不良
l 细胞状态不佳或老化
l 细胞存在污染
#6
细胞不贴壁，有哪些原因？

1）细胞的传代最重要的是胰酶处理时间：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。
解决办法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

2）缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。
解决办法：更换血清。

3）支原体或细菌的污染。
解决办法：分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

4）培养液配置、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。
解决办法：使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2。

5）复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。
解决办法：启用新的保种细胞。

6）如果细胞比较珍贵或没有备份细胞
解决办法：可尝试将不贴壁细胞收集离心，再用PBS将沉淀清洗一遍，离心后的沉淀加入胰酶重新消化接种，同时提高血清浓度到15%-20%。
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三、细胞复苏与冻存



复苏


图6. 细胞复苏流程
1）取出冻存管，立即放入37度水浴箱中快速解冻（1分钟左右），水面不可没过盖子，以避免污染。

2）将冻存管移至无菌操作内。打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm, 5min，弃上清。

3）加入适量完全培养基，置于37度恒温箱中培养即可。

4）次日更换一次培养液,以去除任何残留的冷冻保护剂，继续培养。
冻存


图6. 细胞冻存流程
1）用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基；

2）加入少量 PBS 冲洗二遍， 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，依据传代的方法把细胞 悬液收集于离心管中，离心 1000 rpm，5-8 min；

3）小心弃上清液，加入配置好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后将含有 细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中，每个冻存管加液 1-1.5 ml，细胞最终密度为 （5—10）×106 /ml；

4）冻存管封口，做好标记，按照以下程序冻存：
第一种方法：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-150℃时，则可迅速浸入液氮中。
第二种方法：冻存管放入4℃，约30 min,﹣20℃ 30min- 60 min，见细胞悬液结冻后，放入﹣80 ℃冰箱， 过夜后转入于液氮罐中。
第三种方法：将冻存管放于程序降温盒中，并置于-80℃冰箱4h以上，转入液氮罐中长期保存。
BOSTER
最后，要着重提醒大家：
除了以上实验操作注意事项，使用合格的细胞产品才是实验成功的第一步。那么，众所周知，真正合格的细胞产品需要具备：细胞种属污染鉴定、细胞支原体阴性，以及最重要的细胞STR鉴定。

也许你好不容易完成了实验准备发文章，结果因为产品来源没有经过STR鉴定，文章被退回，这时你可能就意欲“自挂东南枝”了。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/485149126